本发明专利技术提供了一种利用分泌嗜热糖苷酶的工程菌分解造纸浆的方法，包括以下步骤：1）以农作物秸秆为原料，粉碎，浸泡20-30小时形成原料浆；2）扩增分泌嗜热糖苷酶的工程菌种子并经一级和二级菌种培养，当第二菌种的OD值为0.4-0.8时，于25℃-37℃下用0.2-0.7mM的IPTG诱导嗜热糖苷酶的表达；3）将步骤2）所获得的二级菌种液按体积比1：20-40加入到步骤1）的原料浆中，于室温下处理浆液过夜；4）捞出浆料、煮沸、清洗、破碎，抄纸并烘烤成型。本发明专利技术的分泌糖苷酶微生物分解造纸原料浆的效果与常用的酶试剂相当，而且成本大大降低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物酶法造纸
，具体涉及一种表达糖苷酶的微生物菌种及其用于造纸的技术。
技术介绍
由于生物科技的迅猛发展，其他行业受益于其发展成果的优势也越专利技术显，并正在迅速蔓延。造纸行业是众所周知的主要污染行业，尤其在制浆造纸的过程中会产生大量的化学物污染。根据2008年的统计数据表明:中国的制浆造纸产量达到7980万吨，成为全球产量第一的纸业大国，国家也花费了大量的资金用于造纸行业的污水、废气、固体废弃物的治理。将现代生物技术用于造纸行业的节能减排、污染治理是今后最有前景的解决方法。传统造纸是以碱法、亚铵法、亚钠法和半化学法等分解原料浆中的纤维素为生产工艺，该工艺在制浆技术在制浆蒸煮过程中有大量的黑色制浆废液产生、排出，是我国江河、湖泊的主要污染源之一，给人们的生活带来了极大的危害。而我们的酶解法是以可降解的生物酶降解纤维素作为主要生产工艺，以达到绿色环保。 原有的造纸原料主要为木材，小麦等，造成国家自然资源的极大消耗，已经有报道应用农作物如玉米秸杆作为造纸的原料，经查新国外也在近年出现利用香蕉叶进行造纸，但是结果发现很难产业化和应用，因为单一农作物或者单一树叶无法达到纸张的强度、透气性和撕裂度等综合指标的要求。过去，纤维素酶被分为内切型和外切型两类.内切型被认为是不规则地切断纤维素分子链；而外切型被认为是从分子链的非还原末端开始.以纤维二糖为单位将分子链依次分解。不过，如检查一下内切型纤维素酶(EG)和外切型纤维素酶(cBH)将纤维素分解产生的可溶性纤维低糖的分解结构，则上述的分解方式就未必合适。如果只对纤维素分子链，就会在纤维素酶分类为内切型和外切型上产生疑问。有文献还报导了在大麦用CBH处理产生的B — 1，3、1，4 一葡聚糖、以及末葡聚糖水解方式上，也是切断纤维素分子链内部的0-1，4键。此外，在纤维低糖的类似基质上.也确认有同样的情况。因此，如仅检查纤维素分子链的水解方式.刚在所有纤维素酶中，很多都有内切型的性质，在实际意义上，很难说有外切型纤维素酶。金炳铉使用的试剂级酶(SIGMA)，纤维素酶调查有关的表面的纤维和纸张的物理性能的影响。他的调查为内切-β_1，4葡聚糖酶和外切-β-1，4葡聚糖酶。第一内切-β-1，4葡聚糖酶的表面上的原纤化的纤维出现剥离现象。外切-β -1，4葡聚糖酶的纤维，在结束分解纤维素前形成是细胞核开始耗尽，外切-β-1，4葡聚糖酶与破裂的浓度的增加，拉伸强度变大，表示该信息的度分别为78，34，17。然而，内切-β_1，4葡聚糖酶的出现从0.3到最大的效果，显示出两个以上的聚合酶，将在有不利影响时出现互补作用。但是韩国的专利显示尽管他们也使用糖苷酶进行降解纸浆，但还是采用加入糖苷酶试剂的方法，成本较高，而且加入的酶的稳定性不强，保持时间有限，使目前无法真正转化到产业化中使用。实际上糖苷酶(Glycosidase,EC3.2.1)即糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)，又称为糖基水解酶，广泛存在于动物、植物及微生物中。它不仅来源广泛同时也是酶法合成糖苷类化合物的一类重要工具酶，常见的类型如β_半乳糖苷酶、β_葡萄糖苷酶、α—甘露糖苷酶等。到目前为止，已被报道的大多数糖苷酶属常温酶类，由于其热稳定性较差，对有机溶剂不稳定等缺点而不适合用于酶法合成糖苷类化合物，所以，寻找新型稳定的、耐高温的酶源逐渐成为人们关注的焦点。嗜热糖苷酶，因具有良好的热稳定性，较长的半衰期，水解速度快，可采用热处理方法，可以纯化，操作相对方便，污染危险较小等优点。本专利技术利用该酶的特点，将该酶通过基因工程方法在微生物中进行表达，以利用微生物在扩增和不断增长期，不断生长和分泌表达该酶，从而直接连续降解农作物和树叶中主要需要降解的纤维素，替代传统工艺的强碱降解方法，成本低，有长久性应用价值，即环保又降低了纸产品的有害性，真正将生物技术应用到造纸工艺中。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种直接利用分泌嗜热糖苷酶的工程菌分解造纸浆的方法，包括以下步骤: I)以农作物秸杆为原料，粉碎，浸泡20-30小时形成原料浆；2)构建并扩增分泌嗜热糖苷酶的工程菌种子并经一级和二级菌种培养，当第二菌种的OD值为0.4-0.8时，于25°C _37°C下用0.2-0.7mM的IPTG诱导嗜热糖苷酶的表达；3)将步骤2)所获得的二级菌种液按体积比1:20_40加入到步骤I)的原料浆中，于室温下处理浆液过夜；4)捞出浆料、煮沸、清洗、破碎，抄纸并烘烤成型。进一步地，所述分泌嗜热糖苷酶的工程菌是转染了表达质粒pET-28b_0602的大肠杆菌，所述表达质粒pET-28b-0602具有如图2B所示的结构。进一步地，所述农作物秸杆选自配比为1:1_10:1的玉米:小麦秸杆、4:1-9:1的香蕉叶:鱼骨树叶，1:1-5:1的香蕉叶:玉米稻杆、I:1-5:1的香蕉叶:小麦稻杆。本专利技术的另一个目的是提供了所述分泌嗜热糖苷酶的工程菌在分解造纸浆中的应用。本专利技术的又一个目的是提供一种分泌嗜热糖苷酶的工程菌，所述工程菌是转染了表达质粒pET-28b-0602的大肠杆菌，所述表达质粒pET-28b_0602具有如图2B所示的结构。附图说明图1是以超嗜热古细菌的基因组为模板扩增嗜热糖苷酶0602的PCR扩增图；其中，箭头指明目的基因的位置。图2是重组质粒pET-28b_0602的构建过程图；其中，2A是重组质粒pET-28b-0602的构建过程图，2B是质粒pET-28b_0602的结构图。图3是重组质粒pET-28b_0602PCR鉴定结果图；其中，泳道1、2、3、4分别为I至4号克隆；M:DL 2K Plus。图4是鉴定TN0602表达的SDS-PAGE分析图；其中，泳道1-2是TN0602表达产物的上清液；泳道3是pET_28b表达产物的上清液；泳道4-5是TN0602表达产物的沉淀物；泳道6是pET_28b表达产物的沉淀物；泳道7_8是TN0602全表达产物；泳道9是pET-28b的全表达产物；箭头指明目的蛋白的位置。图5是不同诱导温度下目的蛋白的SDS-PAGE分析结果；其中，泳道1-3分别是诱导温度为25°C、30°C、37°C下的TN0602表达产物的上清液；泳道4-6分别是诱导温度为25°C、30°C、37°C下的TN0602表达产物的沉淀物；泳道7_9分别是诱导温度为25°C、30°C、37°C下的TN0602全表达产物；箭头指明目的蛋白的位置。图6是不同浓度IPTG诱导的目的蛋白的SDS-PAGE分析图；其中，泳道1-5分别是IPTG浓度为0mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM、l.0mM诱导下的TN0602表达产物的上清液；泳道6-9分别是IPTG浓度为0mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM、l.0mM诱导下的TN0602表达产物的沉淀物；泳道10-15分别是是IPTG浓度为0mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM、l.0mM诱导下的TN0602全表达产物；箭头指明目的蛋白的位置。图7是目的粗菌液不同热处理时间的SDS-PAGE分析图；其中，泳道1、3、5、7、9 分别是热处理时间为 2min、5min、10min、20min 的 TN0602表达产物的上清液；泳道2、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种直接利用分泌嗜热糖苷酶的工程菌分解造纸浆的方法，包括以下步骤：1）以农作物秸秆为原料，粉碎，浸泡20?30小时形成原料浆；2）构建并扩增分泌嗜热糖苷酶的工程菌种子并经一级和二级菌种培养，当二级菌种液的OD值为0.4?0.8时，于25℃?37℃下用0.2?0.7mM的IPTG诱导嗜热糖苷酶的表达；3）将步骤2）所获得的二级菌种液按体积比1：20?40加入到步骤1）的原料浆中，于室温下处理浆液过夜；4）捞出浆料、煮沸、清洗、破碎，抄纸并烘烤成型。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王妍，吴泽旋，陈莫，喇文军，李云，高仁钧，解桂秋，孔繁思，程金，
申请(专利权)人：深圳职业技术学院，深圳市孚沃德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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