本发明专利技术公开了一种猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，包括100?L?DL2000、20?L?RT-PCR一步法酶、250?L酶缓冲液、300?L?RNase?Free?dH2O、80?L混合引物（浓度各为10μmol/L）、20?L阳性对照及20?L阴性对照。本发明专利技术根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）ORF7?N基因、猪乙型脑炎病毒（JEV）NS1基因序列，设计了2对引物，通过反应条件的优化，成功研制了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪乙型脑炎病毒的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，它对这两种病毒具有敏感性、特异性。可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种试剂盒，尤其是一种猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起怀孕母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状的传染病，俗称猪蓝耳病。乙型脑炎病毒(JEV)又称日本脑炎病毒，是一种人畜共患的病毒性传染病，导致母猪繁殖障碍和人的中枢神经系统疾病，该病不但影响畜牧业尤其是养猪业的发展，而且严重威胁人类健康[3-5]。随着规模化养猪的不断发展，由PRRSV和JEV引起的繁殖障碍较为严重，并常常发生混合感染，给养猪业造成了巨大的经济损失[6]。目前，PRRSV和JEV主要的检测方法有病毒分离鉴定、微量血清中和试验、ELISA、单一病毒RT-PCR，然而这些诊断方法存在操作繁杂、敏感性低、费时费力等不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是:提供一种猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，它能够对临床样品中猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定，该诊断试剂盒的敏感性好、特异性高。本专利技术是这样实现的:猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，包括IOOPL DL2000、2(^L RT-PCR 一步法酶、250μ 酶缓冲液、30(^LRNase Free (ΙΗ^ΑΟμ 混合引物，各引物的浓度均为10 μ mol/L、20 PL阳性对照及20μ 阴性对照；混合引物包括PRRSV上游引物、PRRSV下游引物、JEV上游引物及JEV下游引物；PRRSV上游引物的序列为:5 ’ - CGCCCAACAAAACCAGTCCAGA - 3 ’，PRRSV 下游弓丨物的序列为:5’ - CAGTATATTGCTCGGCAAACT - 3’ JEV上游弓丨物的序列为:5’ -TCCTCGTCATAGGGATTTGCT-3’，JEV下游引物的序列为:5’-AGGCCCAAGGCGTGAGGGCGG - 3，。阴性对照为超纯水。阳性对照为标准猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎RNA RT-PCR产物。所述的RT-PCR — 步法酶由 50% 的甘油、3 mmol/μ L 的 MgC12，25mmol/μ L 的Tris-HCl及0.5 μ L反转录酶组成。所述的酶缓冲液由3的 MgCl2, 500pmol/^L 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L的Tris-HCl组成。为了验证本专利技术的技术效果，进行了以下实验: I材料与方法 1.1病毒和细菌PRRSV北美洲株CH-1a株、JEV弱毒株、PRV闽-1株、PCV-2、PPV强毒株7909、CFSV石门系强毒株F114均由山东滨州畜牧兽医研究院赠送。主要试剂Goldview^ Tris^ EDTA>i^Z2000> PrimeScript I Step Enzyme Mix (RT-PCR 一步法酶)、2X1 Step Buffer (酶缓冲液)、7 舱％ Free dH20等购自宝生物(大连)工程有限公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物(大连)工程有限公司合成。引物设计 根根据GenBank中的PRRSV 0RF7 N基因、JEV NSl基因序列，设计了 2对引物，用于扩增目的基因片段，引物的序列如下，PRRSV上游引物:5’ - CGCCCAACAAAACCAGTCCAGA - 3’，PRRSV 下游引物:5’ - CAGTATATTGCTCGGCAAACT - 3’，预计目的基因片段大小为 245bp JEV 上游引物:5’ - TCCTCGTCATAGGGATTTGCT - 3’，JEV 下游引物:5’-AGGCCCAAGGCGTGAGGGCGG - 3’，预计目的基因片段大小为504bp。病毒核酸的抽提 取待检样品肺、淋巴结、扁桃体、脑等组织样品共约100 mg，加入800μ PBS缓冲液，待检样品研磨后-70°C反复冻融3次12000 r/min离心取上清用于病毒核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA和RNA于-70°C保存。单一病毒RT-PCR扩增 单一病毒的RT-PCR反应在25 PL体系中进行，上下游引物各WL (lOymol/L)、PrimeScript I Step Enzyme Mix 1M-L>2 X I Step Buffer I2.δμ 、模板 lKL,加FreedH20至 25 μ ，反应程序:5(TC 30 min ；94°C 5 min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C I min，30 个循环；最后72°C延伸10 min。取5PLRT_PCR扩增产物于15g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。双重一步法RT-PCR反应条件的优化 双重一步法RT-PCR反应条件，包括退火温度(501:、551:、60°0，引物浓度(5Mmol/L、10 Mmol/L、20 Mmol/L),PrimeScript I Step Enzyme Mix (1ML、2KL)进行优化，以确定最佳反应条件，同时以记Vase Free dH20作为空白对照。双重一步法RT-PCR反应在50 μ 反应体系中进行。反应条件为:50°C 30 min ；94°C 5 min ；94°C 30s，退火温度(50°C、55°C、60°C)30s，72°C I min，30 个循环；最后 72°C 延伸 10 min。取 5μ PCR 扩增产物于 15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。敏感性试验 将提取的病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，2Pg的PRRSV和4Pg JEV RNA将2种病毒RNA混合，经10倍系列稀释的病毒核酸用于双重一步法RT-PCR ；2μδ的PRRSV、4Pg JEVRNA分别经10倍系列稀释的单一病毒核酸用于单一病毒的RT-PCR反应，以确定双重一步法RT-PCR的敏感性。特异性试验 以PRRSV、JEV、CFSV、PRV、PCV-2、PPV为模板分别进行双重一步法RT-PCR反应，以确定双重一步法RT-PCR的特异性。重复性试验 应用建立双重一步法RT-PCR方法，重复检测PRRSV、JEV单一病毒RNA或混合RNA样品3次以检验结果的可靠性。双重一步法RT-PCR试剂盒组成 应用建立的双重一步法RT-PCR方法组装成试剂盒，包括:(I)规2000 ； (2) RT-PCR-步法酶(PrimeScript I Step Enzyme Mix) ; (3)缓冲液(2X I Step Buffer ) ； (4)RNaseFree dH20 ；(5)混合引物；(6)阳性对照；(7)阴性对照。双重一步法RT-PCR试剂盒对临床样品的检测 应用研制的双重一步法RT-PCR试剂盒对2012年贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、铜仁地区几个规模化养猪场和养猪专业户采集的52份病料进行检测，同时结果与单一 PCR检测结果进行对比。 结果与分析 2.1双重一步法RT-PCR产物的鉴定 PRRSV, JE本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT?PCR诊断试剂盒，其特征在于：包括100μL?DL2000、20μL?RT?PCR一步法酶、250μL?酶缓冲液、300μLRNase?Free?dH2O、80μL混合引物，各引物的浓度均为10μmol/L、20?μL阳性对照及?20μL阴性对照；混合引物包括PRRSV?上游引物、PRRSV?下游引物、JEV上游引物及JEV下游引物；PRRSV?上游引物的序列为：5’?–CGCCCAACAAAACCAGTCCAGA–3’，PRRSV?下游引物的序列为：5’–CAGTATATTGCTCGGCAAACT–3’；JEV上游引物的序列为：5’?–TCCTCGTCATAGGGATTTGCT–3’，JEV下游引物的序列为：5’?–AGGCCCAAGGCGTGAGGGCGG–3’。
【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于:包括IOOKL DL2000、2(^L RT-PCR 一步法酶、250μ 酶缓冲液、30(^LRNase Free (1Η20、80μ 混合引物，各引物的浓度均为10 μ mol/L、20 PL阳性对照及20μ 阴性对照；混合引物包括PRRSV上游引物、PRRSV下游引物、JEV上游引物及JEV下游引物；PRRSV上游引物的序列为:5 ’ - CGCCCAACAAAACCAGTCCAGA - 3 ’，PRRSV 下游弓丨物的序列为:5’ - CAGTATATTGCTCGGCAAACT - 3’ JEV上游弓丨物的序列为:5’ -TCCTCGTCATAGGGATTTGCT-3’，JEV下游引物的序列为:5’-AGGCCCAAGGCGTGAGGGCGG - 3，。2.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：余波，冉懋韬，谭诗文，史开志，
申请(专利权)人：贵州省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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