本发明专利技术公开了一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒含有：a)RNA提取液、b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d)RNA酶抑制剂、e)引物、f)标准阳性DNA模板、g)SYBRGreenI实时荧光定量PCR反应液，其特征在于：引物序列分别为正义引物：5’-ACCTATGGTCAACAAGAGTCCGCT-3’，反义引物：5’-CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3’，扩增子大小为142bp，标准阳性DNA模板由已插入仙台病毒保守的NP蛋白编码区142bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A260定量并10倍梯度稀释。结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好，灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。也可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，更具体涉及一种检测仙台病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒的应用，该SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒可高效方便的对小鼠细胞制品进行定量检测和质量监控，也可以进行仙台病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
技术介绍
仙台病毒(Sendai virus, SeV)属副粘病毒科副粘病毒亚科、呼吸道病毒属病毒，呈多形性，主要为球形，直径约200 μ m。SeV是一种单股负链RNA病毒，基因组大小为15kb。SeV是引起啮齿类动物呼吸系统疾病的主要病原，可影响幼鼠发育成长和降低成年鼠的繁殖率，且很难从鼠群中清除。SeV甚至可感染灵长类动物及人类，它主要引起婴幼儿下呼吸道严重疾病及较大儿童的上呼吸道感染，以发热、咳嗽、气喘或胸闷胸痛为主，甚至造成致死性感染。但对较大儿童和成人一般只引起普通感冒症状的上呼吸道感染，很少导致感染死亡。SeV广泛分布于世界各地，其流行或散发常与流感病毒伴发流行。因此《中华人民共和国药典》规定对鼠源性生物制品必须检测仙台病毒。诊断实验小鼠的仙台病毒感染和控制其蔓延都具有积极意义。目前的检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类I、血清学诊断技术包括免疫荧光技术(IFA)、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。2、生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力。`3、分子生物学诊断技术，即应用普通RT-PCR技术检测仙台病毒(YukiharuH, Kiyoka ke T，Michisato K，et al. Detection of nucleoprotein gene of Sendai virusin the lungs of rats by touchdown nested reverse transcription polymerasechain reaction [J]. Experimental Animals, 1997，46 (4)，307-310) 普通 RT-PCR 方法特异性好，检测灵敏度较高，解决了血清学方法无法对无血清生物制品和免疫缺陷小鼠进行检测的缺点。但是由于普通RT-PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以该方法无法定量起始的DNA或RNA拷贝数。近年发展起来的荧光定量PCR(FluOTOgeneticQuantitative PCR，FQ-PCR)技术具有灵敏度高、速度快、特异性好等优点。在基因表达水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM, Dalagaard Mj et al. Quantification of AntiandrogenEffect Determined by Light Cycler Tec hnology[J] · Toxicology，2001，163:29-38)、病原体的定性(Bhudevi Bj Weinstock D.Fluoro genic RT-PCR assay (TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea V irus [J].Vet.Microbiol., 2001, 83:1-10.)和定量检测(Kathy F.J.Tang, Jun Wang, DonaldV.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR witha TaqMan assa y[J].J.Virol.Methods, 115(2004) 109-114.;Birgit Liss.1mprovedquantitative real-time R T-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucleic Acids Res., 2002, Vol.30N 0.17e89.Florence KP, Glaucia PB, Mireille S, etal.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到广泛应用，并且已成为当前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比较多的荧光定量PCR方法有SYBR Green I荧光染料法和TaqMan法，这两种方法都具有灵敏度高、检测速度快、特异性好的优点。本专利技术所采用的基于SYBR GreenI荧光染料技术的荧光定量PCR检测方法其引物设计、合成更加简便，且具有良好的重复性和灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好，灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒在检测(抗)仙台病毒药物研究中的应用，可对小鼠、大鼠细胞制品进行定量检测和质量监控，也可以进行仙台病毒引起的婴幼儿下呼吸道严重疾病及较大儿童的上呼吸道感染的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施:一种检测仙台病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有:a)RNA提取液、b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d)RNA酶抑制剂、e)引物、f)标准阳性DNA模板、g)SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于:引物序列分别为正义引物:5，-ACCTATGGTCAACAAG AGTCCGCT-3，，反义引物:5’ -CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3，，扩增子大小为142bp，标准阳性DNA模板由已插入仙台病毒保守的NP蛋白编码区142bp的pTA2载体(购自Τ0Υ0Β0)转化大肠杆菌DH5a (本实验室保存，大肠杆菌DH5 a为最常用于常规克隆应用的大肠杆菌菌株。除支持蓝/白筛选外，DH5 a的recAl和endAl突变可增强嵌入稳定性并提高自minipreps制备的质粒DNA质量),增殖后提取质粒,并于紫外分光光度计测A26tl定量并10倍梯度稀释。所述的RNA提取液是由细胞裂解液(Trizol,购自Invitrogen)、氯仿、异丙醇、75%(质量体积比，下同)乙醇、灭菌的双蒸水组成。所述的SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液是由2X iTaq SYBR GreenSupermix (with R0X) >10 μ M的正义引物和反义引物和灭菌的双蒸水组成。所述的标准阳性DNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有：a)RNA提取液、b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d)?RNA酶抑制剂、e)?引物、f)?标准阳性DNA模板、g)?SYBR?Green?I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于：引物序列分别为正义引物：5’?ACCTATGGTCAACAAGAGTCCGCT?3’，反义引物：5’?CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT?3’，扩增子大小为142bp，标准阳性DNA模板由已插入仙台病毒保守的NP蛋白编码区142bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A260定量并10倍梯度稀释。
【技术特征摘要】
1.一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有:a)RNA提取液、b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d) RNA酶抑制剂、e)引物、f)标准阳性DNA模板、g) SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于:引物序列分别为正义引物:5’ -ACCTATGGTCAACAAGAGTCCGCT-3’，反义引物:5’ -CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3’，扩增子大小为142bp，标准阳性DNA模板由已插入仙台病毒保守的NP蛋白编码区142bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5 α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A26tl定量并10倍梯度稀释。2.根据权利要求1所述的一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于:所述的RNA酶抑制剂提取液是由细胞裂解液、氯仿、异丙醇、75%质量体积比乙醇、灭菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖庚富，张哲，郑从义，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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