本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因pi5的检测方法。本发明专利技术公开了一种抗稻瘟病基因pi5的显性分子标记pi5-2-2，它是用引物对SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2从水稻总DNA中扩增出的核苷酸序列，可以应用于水稻稻瘟病抗性育种中pi5的分子标记辅助选择，以提高抗病品种选育的效率，减少田间鉴定的工作量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及。
技术介绍
稻痕病(Pyriculariagrisea cav.)是由稻痕病菌(Magnaporthe oryzae ;无性态:Pyri cu I aria)引起的水稻病害,其分布范围十分广泛。据统计,全世界有80余个国家均有发生，一般流行年份可造成10 % -20 %的减产，严重发生时则达到40 % -50 %。20世纪90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在380万hm2以上，每年损失稻谷达数亿千克。随着品种应用的单一化、集中化以及气候的影响，稻瘟病的危害也越来越重。尽管人们在病害防治上耗费了巨大的精力和物质投入，但限于诸多方面因素的影响，防病效果一直不尽人意，尤其在病害严重发生年份，常常给生产、育种造成重大损失。以辽宁省为例，自20世纪90年代起，分别发生了因辽粳287、辽盐241、辽粳454和辽星I号几个主栽品种抗病性退化导致的穗颈瘟大面积发生，严重影响了北方粳稻的生产。产生这种现象的根本原因就是主栽品种对稻瘟病菌的抗谱狭窄，且单 一化、集中化种植现象普遍，这样一旦稻瘟菌流行小种发生变化，品种对稻瘟病的抗性便迅速下降。因此，选育聚合多基因或具广谱抗性的水稻品种尤为必要。目前，在抗稻瘟病品种选育的过程中，育种家主要采用系谱法，或结合分子标记辅助选择抗病个体。传统的系谱法通过两亲本组配，从分离后代中择优选育品种，抗瘟表型依赖于田间自然鉴定或人工接种鉴定，鉴别难度大，准确率低。由于不了解亲本的抗瘟基因型，育种者在亲本选择上非常盲目，通常是海量配组，海量选择后代，工作量大，育种效率低。在利用分子标记辅助选择进行抗病育种时，所选用的多是与抗病基因连锁的SSR标记，易造成假阳性的判断，如能根据抗感等位基因本身的序列差异来设计不同基因的共分离标记，不仅可首先检测亲本所携带的抗瘟基因，也能在后代辅助选择时大大提高抗性品种选择的准确性。水稻抗稻痕病基因Pi5 (Jeon J S, et al.Genetic and physical mappingof Pi5 (t), a locus associated with broad-spectrum resistance to rice blast.Molecular Genetics and Genomics,2003,269(2):280-289 ；ffang G L, et al..RFLPMapping of Genes Conferring Complete and Partial Resistance to Blast in aDurably Resistant Rice Cultivar Genetics, 1994,136 (4): 1421-1434)位于水稻第 9 染色体上S04G03和C1454之间的170kb区间内，包含两个独立遗传的NBS-LRR类基因(Pi5_l和Pi5-2)，且两个基因的蛋白产物在氨基端都有CC结构。Pi5-1和Pi5-2分别有5和6个外显子，蛋白产物分别含有1025和1063个氨基酸；基因表达分析表明Pi5-1受病原菌诱导表达，而Pi5-2是组成性表达，在温室人工接种条件下对P06-6等5个稻瘟病小种表现完全抗性，Pi5基因原始抗性供体为RIL260 (Wang G L, et al..RFLP Mapping of GenesConferring Complete and Partial Resistance to Blast in a Durably Resistant RiceCultivar Genetics,1994,136(4):1421-1434)。
技术实现思路
为了高效选择抗稻瘟病水稻品种，有针对性的、特异性的选择含Pi5基因的后代材料，本专利技术提供一种用于检测水稻抗稻瘟病基因Pi5的分子标记pi5-2-2，该分子标记与Pi5基因共分离，可以用于Pi5基因的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及抗病品种选育的效率。本专利技术提供如下解决方案:一种与水稻抗稻瘟病基因pi5连锁的分子标记pi5-2_2，如SEQ ID NO:3所示，所述分子标记pi5-2-2与水稻抗稻痕病基因pi5共分尚。一种用于检测分子标记pi5-2-2是否存在的引物对DNA，如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2 所示。一种检测水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列为引物，扩增待检测DNA，且扩增子含有如SEQ ID NO:3 (885bp)所示序列即为含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。一种抗稻瘟病水稻品种分子标记辅助选择方法，以含有抗稻瘟病基因pi5的水稻材料为亲本，与其他水稻品种杂 交，提取杂交后代个体基因组DNA，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示序列为引物进行PCR扩增，且扩增子含有如SEQ ID NO:3所示序列的对应个体即含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。上述引物对优选对水稻苗期所提取的DNA进行标记鉴定，检测是否携带抗稻瘟病基因Pi5，该分子标记准确率高，检测方便，可以作为水稻稻瘟病抗病育种中pi5基因分子标记辅助选择的应用。附图说明图1是分子标记pi5-2_2在抗稻瘟病基因Pi5供体品种RIL260、pi5单基因系和5个高感水稻品种中扩增产物的凝胶电泳图；其中，M:2000bp分子量标记(TIANGEN MD114-02)，200ng ;片段长度分别为:lOObp,250bp，500bp，750bp，lOOObp,2000bp。I:RIL260 ；2:丽江新团黑谷；3:辽盐241 ；4:盐丰47 ；5:日本晴；6:辽星I号；7:Pi5单基因系其中抗病基因供体品种RIL260、pi5单基因系扩增产物片段大小为885bp，而感病品种无扩增产物。图2是分子标记pi5-2-2在抗稻瘟病基因Pi5供体品种RIL260、pi5单基因系(从IRRI引进)及9个水稻品种中扩增产物的凝胶电泳图。其中，M:2000bp分子量标记(TIANGEN MD114-02)，200ng ;片段长度分别为:IOObp,250bp,500bp,750bp,lOOObp,2000bp。I:RIL260 ；2:丽江新团黑谷；3:辽粳454 ；4:辽粳371 ；5:沈农265 ；6:辽农979 ；7:沈稻7 ；8:越光；9:pi5单基因系；10:港源8号；11:辽盐241。其中6号品种辽农979扩增产物片段产度和pi5单基因系及供体品种RIL260 —致，进一步测序结果表明其扩增产物序列与SEQ ID NO:3所述序列一致，确定携带抗稻瘟病基因pi5，而其余品种均无PCR扩增产物，说明不含有抗稻瘟病基因pi5。具体实施例方式实施例1:DNA提取、PCR扩增和电泳分析 一、DNA 提取(CTAB 法):称取0.1 0.2g水稻叶片并剪成Icm长，在液氮中研磨，待液氮蒸发完后(注意:勿使样品融化)，迅速转入含65°C预热过的提取液(1M Tris pH8.0, IOOmM ；5M NaCl, 1.0M ；0.5M EDTA, 20mM ；10% CTAB, 2.0% )400 μ L 的离心管中。轻轻摇匀。60 65°C水浴30 60分钟本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示序列为引物，扩增待检测DNA，且扩增子含有如SEQ?ID?NO：3所示序列即为含有水稻抗稻瘟病基因pi5。
【技术特征摘要】
1.一种检测水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ ID NO :1和SEQID NO :2所示序列为引物，扩增待检测DNA，且扩增子含有如SEQ ID NO :3所示序列即为含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。2.一种抗稻瘟病水稻品种分子标记辅助选...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵家铭，马丽，陆晓春，郑文静，丛玲，
申请(专利权)人：辽宁省农业科学院，郑文静，陆晓春，
类型：发明
国别省市：
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