定点重组的组合物和方法技术

技术编号:8956312 阅读:151 留言:0更新日期:2013-07-25 01:17
本申请提供了能够在靶核苷酸序列中定点重组外源序列的组合物和方法,特别地,在靶核苷酸序列的高表达位点中定点重组外源序列的组合物和方法。其中,所述靶核苷酸序列可以是人的基因组。本申请还提供了在染色体上含有高表达位点的宿主细胞。在所述宿主细胞中含有本申请提供的定点重组的组合物,或者在其染色体的高表达位点中定点重组了外源序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
,具体涉及可用于在人基因组中特定的位点进行基因重组的组合物和方法,以及由此产生的基因修饰的细胞。
技术介绍
基因打靶是根据同源重组的原理而设计的一项技术。在这一技术中,体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”,经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”,这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机重组,而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点重组。外源基因导入前必须经过精巧的构建,经构建的外源基因称为打靶载体(targeting vector)。基因打祀的结果有如下可能:(I)祀基因被灭活,即基因敲除,当打革El载体中插入一个特定的DNA序列就可以实现基因敲除(gene knockout)。(2)祀基因被导入的外源基因替代,可以是以正常基因替代突变的基因。(3)在受体细胞基因组中定点引入一个原本不存在的完全新的基因,称之为基因敲入(gene knockin)。历经30多年的发展,研究者们通过逆转录病毒介导、转座子介导、乙烷亚硝基诱变、限制性内切酶产生DNA双链断裂等方法结合位点特异性重组酶进行了大量的基因打靶实践,已经在酵母、果蝇、植物、小鼠、人类干细胞的基因修饰、基因删除、基因替换等方面取得了显著的成果。继2006年诺贝尔医学奖授予让致病基因沉默的RNA干扰技术之后,2007年诺贝尔医学奖又颁 发给了基因敲除技术。两者都属于生物学中极为重要的重组DNA
然而,传统的基因重组技术,如Cre-1oxP和FLP-FRT基因重组系统等,由于①细胞内的同源重组频率低下( 10_6),远低于非同源末端连接(二者比例为1: 10 000 1:1000);②外源DNA进入细胞后,绝大多数会借助非同源末端连接途径随机插入基因组,容易造成功能基因断裂、原癌基因激活、染色体缺失、重排,最终外源基因沉默或者细胞癌变;③加之细胞的DNA转化率低(通常1% -5% ),需要大量的处理细胞,以至于在后期的筛选工作中需要耗费大量的人力、物力和时间。这些问题成为当前限制其发展和推广应用的瓶颈。为了解决这些问题,研究者们需要在提高同源重组效率和建立高效的后期筛选方法两个方面进行大量的探索。锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)技术的出现促使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步,主要体现在整合效率由传统技术的0.0001%提高到1% -20%。Sigma公司基于此项技术,开发了使用重组腺相关病毒(rAAV)载体可将外源基因定点引入人19ql3.4 AAVSl位点和鼠Rosa26位点的试剂盒。AAV载体虽然已被证明是唯一具有定点整合特性的载体,然而,其包装能力限制了打靶载体的长度,外源DNA长度为4.1-4.9kb时其包装效率最高。且对于许多研究者而言,设计出特异性靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是一个相当大的技术挑战,4-6个月的实验周期将耗费大量的人力和财力。事实上,由于病毒载体发生的随机整合激活了 LM02表达,致使接受2年基因治疗的SCID-XI患者又换上了白血病,已引发了对基因治疗可行性的争议和安全性的重视。现已证实,重组腺相关病毒载体一旦去除R印基因,即会失去定点整合能力,其随机整合便会造成染色体缺失、重排和功能基因被打断等后果。近年,来自Sangamo BioSciences公司和哈佛大学两个研究小组的两篇研究论文发表在同一期的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上,分别介绍了一种类似的基因组祀向修饰技术-TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases)技术,即植物病原体中的一种转录激活子样效应因子(transcription activator-like effector, TALE)表现出了 DNA结合特异性,不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基,TALEs上的每个重复可变的d1-residues (RVDs)位点仅能识别一个碱基。将TALE的DNA结合功能域与野生型FokI限制酶引发DNA双链断裂的功能域连接形成重组蛋白,就形成了一种基于引发同源重组的基因组靶向修饰技术。可是,合成出如此多重复序列的TALEs是很困难的,而且其脱靶活性以及基本生物特性包括结构和亲和力等尚待研究。迄今为止,全世界科学家利用基因打靶技术已经对上万种基因的功能进行了研究,由此催生出新的药物(如癌基因靶向治疗药物)以及新的疾病治疗方法(如血友病基因治疗方法)等,并培育了上千种存在不同基因变异的人类疾病动物模型和细胞株模型。但是,基因打靶技术仍然存在诸多不足之处:①由于外源基因整合位点常常不在转录活跃区域,很多基因打靶的敲入基因表达量低且不稳定;②通常基因打靶敲入需要置换体内一些原有的基因,这极有可能影响细胞基因组的稳定性,改变邻近基因的功能,内环境平衡被打破,细胞的生物学特性也将发生改变,基因工程下游的生产工艺优化困难重重;③基因打靶的基因敲入技术利用的同源重组靶位点通常为单拷贝序列,与载体发生同源重组的概率极低,即定点整合效率太低。目前,安全、高效、稳定的基因打靶优选靶位点少见报道,且现有的基因重组技术也有诸多不足之处有待改进。
技术实现思路
本申请提供了能够在靶核苷酸序列中定点重组外源序列的组合物和方法。在一方面,本申请提供了分离的多核苷酸,其含有高表达位点的至少7个连续核苷酸,其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。在某些实施方式中,所述高表达位点选自下组:HumanGenome.1TSl 到 HumanGenome.1TS155。在另一方面,本申请提供了低聚化合物,含有可特异性杂交于靶位点的靶区域,所述靶位点含有高表达位点的至少7个连续核苷酸,其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。在某些实施方式中,所述靶区域含有低聚的核苷酸。所述靶区域可以含有至少一个修饰的核苷酸。至少一个所述修饰的核苷酸可以是锁核酸。在某些实施方式中,所述靶区域是5’ 一 3’走向的,且所述靶位点是3’ 一 5’走向的,或者所述靶区域是3’ 一 5’走向的,且所述靶位点是5’ 一 3’走向的。在某些实施方式中,所述靶区域与所述靶位点有50%到100%的互补性。在某些实施方式中,低聚化合物进一步含有能够与第二低聚化合物形成结合的结合区域。所述结合可以是碱基配对、共价键、非共价键、共价接头、或非共价接头。所述结合区域可以连接在所述靶区域的5’上游,或连接在所述靶区域的3’下游。在某些实施方式中,所述结合区域可以含有核苷酸,在某些实施方式中也可以含有至少一个修饰的核苷酸,在某些实施方式中至少一个所述修饰的核苷酸是锁核酸。在另一方面,本申请提供了低聚构建体,其含有:第一低聚化合物,其含有与第一结合区域连接的第一 5’一 3’靶区 域;第二低聚化合物,其含有与第二结合区域连接的第二3’一 5’靶区域;以及在第一结合区域和第二结合区域之间的结合;其中:所述第一 5’一 3’靶区域与第一 3’ 一 5’靶位点可特异性杂交;所述第二 3’ 一 5’靶区域与第二 5’ 一 3’靶位点可特异性杂交;且所述第一 3’ 一 5’靶位点和所述第二 5’ 一 3’靶位点各含有高表达位点的至少7个连续核本文档来自技高网
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【技术保护点】
分离的多核苷酸,其含有高表达位点的至少7个连续核苷酸,其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。

【技术特征摘要】
2012.01.20 CN 201210018041.41.分离的多核苷酸,其含有高表达位点的至少7个连续核苷酸,其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸,其中所述高表达位点选自下组:HumanGenome.1TSl 至Ij HumanGenome.1TS155。3.低聚化合物,含有可特异性杂交于靶位点的靶区域,所述靶位点含有高表达位点的至少7个连续核苷酸,其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。4.如权利要求3所述的低聚化合物,其中所述靶位点含有所述高表达位点的3’一 5’链的至少7个连续核苷酸,所述高表达位点选自下组:HumanGenome.1TSl到HumanGenome.1TS155。5.如权利要求3所述的低聚化合物,其中所述靶位点含有所述高表达位点的5’一3’链的至少7个连续核苷酸,所述高表达位点选自下组:HumanGenome.1TSl到HumanGenome.1TS155。6.如权利要求3-5任一所述的低聚化合物,进一步含有能够与第二低聚化合物结合的结合区域,所述结合区域与靶区域连接。7.如权利要求6所述的低聚化合物,其中所述第二低聚化合物含有第二靶区域和第二结合区域。8.如权利要求7所述的低聚化合物,其中所述第二靶区域与第二靶位点特异性杂交,所述第二靶位点含有在人染色体或基因组中存在的高表达位点的至少7个连续核苷酸,其中所述第一靶位点和所述第二靶位 点在所述高表达位点的相反链上。9.低聚构建体,含有: 第一低聚化合物,其含有与第一结合区域连接的第一 5’ 一 3’靶区域; 第二低聚化合物,其含有与第二结合区域连接的第二 3’ 一5’靶区域;以及 在第一结合区域和第二结合区域之间的结合; 其中: 所述第一 5’ 一 3’靶区域与第一 3’ 一 5’靶位点可特异性杂交;所述第二 3’ 一 5’靶区域与第二 5’ 一 3’靶位点可特异性杂交;且 所述第一 3’ 一 5’靶位点和所述第二 5’ 一 3’靶位点各含有高表达位点的至少7个连续核苷酸,其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。10.如权利要求9所述的低聚构建体,其中所述第一5’一 3’靶区域与所述第一 3’一 5’靶位点有50%到100%互补性,和/或所述第二 3’ 一 5’靶区域与所述第二 5’ 一 3’靶位点有50 %到100 %互补性。11.如权利要求9所述的低聚构建体,其中所述第一3’一 5’靶位点含有所述高表达位点的3’ 一 5’链的至少7个连续核苷酸,所述高表达位点选自下组:HumanGenome.1TSl到HumanGenome.1TS155。12.多核苷酸供体,含有第一5’ 一3’同源位点,所述同源位点含有高表达位点的5’一 3’链的至少7个连续核苷酸的同源序...

【专利技术属性】
技术研发人员:凌建群凤阁
申请(专利权)人:江苏吉锐生物技术有限公司
类型:发明
国别省市:

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