一种单宁酶高产菌株及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种单宁酶高产菌株及其制备方法。以自然界腐烂的五倍子为原料，在以单宁酸为唯一碳源的培养基中通过对腐烂五倍子中的微生物筛选，获得一种产单宁酶活力较高的菌株T3，对该菌株进行60Coγ射线辐照诱变，再经平板初筛和摇瓶发酵复筛，最终得到一编号为T3-5-1的菌株，其所产单宁酶活力比T3菌株所产单宁酶活力提高了122.12%。经菌种鉴定，菌株T3-5-1为黑曲霉(Aspergilluseniger)，保藏号为CGMCCNo.7423。本发明专利技术的菌株在最优培养条件下产单宁酶，经分离纯化后其比活力高达5304.53U/mg，远高于美国Sigma公司所产单宁酶比活力1788.15U/mg。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物
，具体涉及微生物筛选、诱变选育、菌种鉴定及发酵产酶相关领域，特别是提供了。
技术介绍
单宁酶(Tannase,E.C.3.1.1.20),全称单宁酰基水解酶(Tannin AcylHydrolase)，是一种广泛存在于微生物及植物中的诱导酶，尤其是在丝状真菌中，以单宁酸、五倍子等作为诱导物时可大量产生，属于细胞膜结合酶，可分泌到胞外。单宁酶可专一性水解型单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸、葡萄糖及相应的醇类等物质。单宁酶目前已应用于饮料、酿酒、食品、医药、化工、制革及化妆品等多个领域，尤其在制备没食子酸、没食子酸丙酯及处理茶汁“冷后浑”和啤酒沉淀等方面应用广泛。但目前单宁酶生产效率不高，且市场价格非常昂贵，这阻碍了单宁酶的进一步应用。经文献查新得知，目前生产单宁酶的主要方法还是通过微生物发酵制备，尤其对曲霉属、青霉属、根霉属的真菌及乳杆菌等细菌发酵生产单宁酶的报道较多。但目前存在着这些微生物大多产酶不高，尤其是国内对单宁酶高产菌株缺乏自主知识产权等问题。
技术实现思路
本专利技术目的是针对以上存在的问题，提供一种单宁酶高产菌株及其生产方法，从而提高单宁酶发酵产量，解决当前单宁酶生产效率不高的问题。本专利技术筛选出的一株单宁酶高产菌株命名为T3-5-1，经菌种鉴定为黑曲霉(Aspergilluse niger),保藏号为CGMCC N0.7423,保藏时间:2013年4月7日，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本专利技术的菌株的制备方法包括以下步骤: (O挑取腐烂的五倍子，配制成KT1的溶液，梯度稀释至10_1(|，各梯度于筛选培养基上涂平板3个，30 °C培养48 h，挑取平板上菌落较大以及水解圈较大的单菌落于试管PDA斜面保存，所述筛选培养基由以下组份配制而成:磷酸二氢钾4.38g，硫酸铵8.76g，硫酸镁0.88g，氯化钙0.088g,氯化锰0.018g,钥酸钠0.0088g,硫酸铁0.12g，琼脂30g,单宁酸IOg,用蒸懼水水溶解后定容至I L; (2)将(I)w所得菌株于察氏培养基斜面上进行活化，配制IO6个/mL的孢子悬浮液，接种I mL于30 mL发酵培养基中，30 °C, 120 r/min振荡培养72 h，提取单宁酶并测其活力，所述发酵培养基由以下组份配制而成:单宁酸20g，蔗糖10g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾lg，氯化钾0.5g,硫酸铁0.0lg,硫酸镁0.5g,用蒸懼水溶解后定容至I L ； (3)将初筛得到的菌株接种于察氏培养基斜面，30°C培养3-4天，待孢子成熟后，用IOmL生理盐水将孢子洗至装有玻璃珠的三角瓶中，30 1:振荡培养1-2 h，使孢子充分分散，用脱脂棉过滤，得单孢子悬液，取I mL单孢子悬液进行梯度稀释并镜检计数，调整孢子浓度至 IO6 个 /mL ; (4)在试管中装入IO6个/mL单孢子悬浮液3mL，进行6tlCo Y射线辐照诱变，辐射剂量为400 600Gy ； (5)辐照后，取ImL单孢子悬浮液，用10倍稀释法稀释，取100 μ L涂布于筛选培养基上，30 °C倒置培养，待培养皿中长出菌落后，斜面保存，所述筛选培养基与步骤(I)筛选培养基相同； (6)将筛选出的菌株，于察氏培养基斜面上活化，配制IO6个/mL的孢子悬浮液，接种ImL于50 mL发酵培养基中，30 °C, 120 r/min振荡培养72 h，然后进行单宁酶提取及酶活力测定。步骤(I)和步骤(5)中，所述所述筛选培养基由以下组份配制而成:磷酸二氢钾4.38g，硫酸铵8.76g，硫酸镁0.88g，氯化钙0.088g，氯化锰0.018g，钥酸钠0.0088g，硫酸铁0.12g，琼脂30g，单宁酸10g，用蒸馏水水溶解后定容至I L。步骤(2)和步骤(6)中，所述所述发酵培养基由以下组份配制而成:单宁酸20g，蔗糖10g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾lg，氯化钾0.5g，硫酸铁0.0lg,硫酸镁0.5g，用蒸馏水溶解后定容至I L。步骤(2)和步骤(6)中，所述单宁酶提取及酶活力测定方法，包括以下步骤: a、发酵悬浮液经抽滤后得到菌丝体，蒸馏水洗至pH值中性，于冰箱中预冷，将菌丝体、石英砂、柠檬酸缓冲液按体积比1:1:4混合，在冰浴下研磨成浆，0-4 1:下10000 r/min离心30 min，取上清液，用柠檬酸缓冲液定容至10 mL，即得单宁酶粗酶液。所述柠檬酸缓冲液配制方法为:准确称取柠檬酸21.01 g，加水定容至1000 mL，作为A液；准确称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000 mL,作为B液，将A液与B液按1:2比例混合，再用A液和B液调混合液的pH值至5.0，即得柠檬酸缓冲液。b、准备I支对照管、I支空白管和3支平行测定管，先在每支试管中各加入I mL单宁酶粗酶液，45 1:水浴预热10 min，然后在测定管中各加入I mL没食子酸丙酯溶液，在空白管中加入I mL柠檬酸缓冲液，在对照管中加入0.6 mL乙醇，反应20 min后，分别在测定管和空白管中加入4 mL乙醇终止反应，在对照管中加入I mL没食子酸丙酯溶液。待反应液冷却后，用柠檬酸缓冲液稀释9倍，测定270 nm下吸光值。所述没食子酸丙酯溶液的配制方法为:准确称取0.2122 g没食子酸丙酯，用柠檬酸缓冲液定容至500 mL。C、用柠檬酸缓冲液分别配制20、40、60、80、100 μ mol/L的没食子酸丙酯溶液，测定其270 nm下的吸光值，绘制回归曲线，根据该回归曲线的直线回归方程，对照管没食子酸丙酯浓度应为93.343AW-1.6626，测定管没食子酸丙酯浓度则为93.343A* -1.6626，按下列公式计算酶活力:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单宁酶高产菌株，经菌种鉴定为黑曲霉，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC?No.7423。

【技术特征摘要】
1.一种单宁酶高产菌株，经菌种鉴定为黑曲霉，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.7423。2.一种单宁酶高产菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (O挑取腐烂的五倍子，配制成KT1的溶液，梯度稀释至10_1(1，各梯度于筛选培养基上涂平板3个，30 °C培养48 h，挑取平板上菌落较大以及水解圈较大的单菌落于试管PDA斜面保存； (2)将(I)所得菌株于察氏培养基斜面上进行活化，配制IO6个/mL的孢子悬浮液，接种I mL于30 mL发酵培养基中，30 °C, 120 r/min振荡培养72 h，提取单宁酶并测其活力； (3)将初筛得到的菌株接种于察氏培养基斜面，30°C培养3-4天，待孢子成熟后，用IOmL生理盐水将孢子洗至装有玻璃珠的三角瓶中，30 1:振荡培养1-2 h，使孢子充分分散，用脱脂棉过滤，得单孢子悬液，取I mL单孢子悬液进行梯度稀释并镜检计数，调整孢子浓度至 IO6 个 /mL ; (4)在试管中装入IO6个/mL单孢子悬浮液3mL，进行6tlCo Y射线辐照诱变，辐射剂量为400 600Gy ； (5)辐照后，取ImL单孢子悬浮液，用10倍稀释法稀释，取100 μ L涂布于筛选培养基上，30 °C倒置培养，待培养皿中长出菌落后，斜面保存，所述筛选培养基与步骤(I)筛选培养基相同； (6)将筛选出的菌株，于察氏培养基斜面上活化，配制IO6个/mL的孢子悬浮液，接种ImL于50 mL发酵培养基中，30 °C, 120 r/min振荡培养72 h，然后进行单宁酶提取及酶活力测定。3.根据权利要求2所述的单宁酶高产菌株的制备方法，其特征在于，步骤(I)和步骤(5)中，所述所述筛选培养基由以下组份配制而成:磷酸二氢钾4.38g，硫酸铵8.76g，硫酸镁0.88g，氯化钙0.088g,氯化锰0.018g,钥酸钠0.0088g,硫酸铁0.12g，琼脂30g,单宁酸IOg,用蒸懼水水溶解后定容至I L。4.根据权利要求2所述的单宁酶高产菌株的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(6)中，所述所述发酵培养基由以下组份配制而成:单宁酸20g，蔗糖10g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾lg，氯化钾0.5g,硫酸铁0.0lg,硫酸镁0.5g,用蒸懼水溶解后定容...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹庸，张帅，林健辉，农嘉仪，朱华伟，
申请(专利权)人：曹庸，
类型：发明
国别省市：