本发明专利技术属于基因工程领域，具体的说是一种减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用。所述减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白具有序列表SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:11、SEQ?ID?NO:13或SEQ?ID?NO:15中碱基序列。以金黄色葡萄球菌DNA为模板，以引物对进行PCR扩增，然后以sec2-F和sec2-R为引物，以获得PCR产物为模板进行PCR扩增得到突变基因，将其克隆入pET-28a，构建减毒肠毒素C2突变蛋白的基因工程菌。本发明专利技术所述突变蛋白在保持一定超抗原活性的基础上，其催吐和致热活性较野生型肠毒素C2蛋白有显著的降低，达到了降低毒副作用的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体的说是一种减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
超抗原(superantigen, SAg)是一组由细菌或病毒编码的，并在极低浓度下对人体或其他哺乳动物T淋巴细胞产生极强免疫刺激活性的蛋白质分子。不像传统的抗原，超抗原不需要抗原递呈细胞的加工处理，在抗原递呈细胞外侧的抗原结合区与MHC II (组织相容性复合物)分子和T细胞V β区结合形成复合物，从而激发大量的T淋巴细胞增殖，进而导致在体外或体内释放产生大量的细胞因子和其它效应分子。正因为超级抗原存在这种特殊的生物活性和作用机理，所以致使其可以作为一种临床上的免疫调节剂和抗肿瘤药物，用于表达MHC II分子的肿瘤治疗。金黄色葡萄球菌肠毒素C2 (Staphylococcal enterotoxin C2, SEC2)是一类具有代表性的微生物外毒素。由于其极强的T细胞激活功能，成为一类典型微生物超抗原，近年来受到人们的广泛关注。但是，由于肠毒素C2超抗原的作用必须依赖于与免疫系统中的MHC II分子相结合，这必然会导致其在人体中可能与来自正常组织或细胞的MHC II分子的结合，从而对正常细胞也产生一定的毒性作用；此外，由于金黄色葡萄球菌肠毒素是一种细菌外毒素，因此在对人体会产生一定的毒素综合症(TSS)和食物中毒症状，并在临床上表现为呕吐、腹泻、以及致热等症状，因此限制了其临床应用和治疗可得效果。 因此,为减少肠毒素C2作为细菌外毒素所带来的边际效应和对人体的毒副作用，进而提高肠毒素C2在未来抗肿瘤方面的开发潜力，本专利技术通过基因定点突变技术对SEC2中与毒性相关的位点进行突变，从而达到减毒的目的。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下:减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白:所述减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白具有序列表SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11、SEQID NO: 13或SEQ ID NO: 15中碱基序列。所述减毒肠毒素C2超抗原突变编码蛋白具有序列表SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:16中氨基酸序列。减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (C93A) -R: 5’ -GATGAAAAATATG CGTTTACATAG-3’ ; sec2 (C93A) _F: 5’ -ATGTAAACGCATATTTTTCATCCAA-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTT GTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO:1中碱基序列sec2(C93A)突变基因；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ’和 sec2(D83A)-R:5 ’-TCCATACACAGCA ACTACTTCATCT-3 ’；sec2(D83A)-F:5 ’-GATGAAGTAGTTGCTGTGTATGGAT CAAAT-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 3中碱基序列sec2(D83A)突变基因；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2(H47A)-R:5，-GTTATAAATTAA ATCTGCTGCCAAA-3，；sec2(H47A)-F:5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATA AC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 5中碱基序列Sec2(H47A)突变基因；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F: 5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和 sec2(H118A)-R:5’-GGTTTCCTTCAGC TTTTGTTATTCC3’；sec2(H118A)_F:5’_GGAATAACAAAAGCTGAAGGAAAC CAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 7中碱基序列sec2(H118A)突变基因；以具有序列表SEQ ID N0:1中碱基序列sec2(C93A)突变基因为模板，采用引物对 sec2-F:5，-CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2 (C93A/C110A)-R:5，-CCTCCATACATAGCAGTTTTACCAC-3’ ； sec2 (C93A/C110A)_F:5，-TGGTAAAACTGCTA TGTATGGAGGA-3，和sec2-R:5’ -TCGCTCGAGT TATCCATTCTTTGTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2_R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ IDNO: 9中碱基序列sec2 (C93A/C110A)突变基因;以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F: 5’CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2(H122A)-R:5’-CCATTATCAAAGGCGTT TCCTTC-3’ ;sec2(H122A)_F:5’-GGAAACgCCTTTGATAATGGGAAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 11中碱基序列Sec2(H122A)突变 基因；以SE本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白，其特征在于：所述减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白具有序列表SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:11、SEQ?ID?NO:13或SEQ?ID?NO:15中碱基序列。
【技术特征摘要】
1.一种减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白，其特征在于:所述减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白具有序列表 SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO:1USEQ ID N0:13 或 SEQ ID N0:15 中碱基序列。2.—种权利要求1所述的减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白，其特征在于:所述减毒肠毒素C2超抗原突变编码蛋白具有序列表SEQ ID N0:8、SEQ IDNO:12,SEQ ID NO: 14或SEQ IDNO: 16中氨基酸序列。3.一种按权利要求1所述的减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法，其特征在于: 以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ’ 和 sec2(HI18A)-R:5 ’-GGTTTCCTTCAGCTTTTGTTATTCC3’;sec2(HI18A)-F:5 ’-GGAATAACAAAAGCTGAAGGAAAC CAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 7中碱基序列Sec2(H118A)突变 基因； 以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’ CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和 sec2 (H122A)-R:5’-CCATTATCAAAGGCGTTTCCTTC-3’;sec2(H122A)-F:5’-GGAAACgCCTTTGATAATGGGAAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ IDNO: 11中碱基序列sec2(H122A)突变基因； 以SEQ ID N0:7中碱基序列Sec2(H118A)突变基因为模板，采用引物对sec2-F:5’ -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (H118A/H122A)-R: 5’ -CCATTATCAAAGGCGTTTCCTTC-3， ；sec2(H118A/H122A)-F:5， -GGAAACGCCTTTGATAATGGGAAC-3，和 sec...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小刚，徐明恺，张惠文，刘昌孝，陈艳，陈巨余，
申请(专利权)人：沈阳协合集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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