鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法，它涉及鸡传染性支气管炎纳米活苗的制备方法。本发明专利技术是要提供鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法，方法为：一、取病毒液并加入到过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中，搅拌得到混合溶液A；二、向混合溶液A中滴加过滤除菌后的羧甲基壳聚糖溶液得到混合溶液B；三、将混合溶液B离心然后用温度为4℃的无菌去离子水洗涤沉淀3遍，收集固相物；四、将固相物加入到4℃的无菌去离子水中，然后再加入5％蔗糖脱脂乳溶液，再真空冷冻干燥，即完成。本发明专利技术应用于兽药领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鸡传染性支气管炎纳米活苗的制备方法。
技术介绍
传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染的病毒性疾病，以呼吸道症状、产蛋率下降、肾脏病变等为特征。自1988年以来，在我国大部分地区相继流行，发病率100%，死亡率10% 30%。由于集约化养殖对环境的污染和不断出现新的病毒变异毒株，且常常是基因型表现不一和血清型变异交替或同时发生，组织嗜性也不断变化，使IBV的免疫防控难度大，免疫失败的现象时有发生。这两种疫病严重危害养鸡业的发展。及时进行免疫接种是预防鸡传染性支气管炎发生的重要以及主要措施。目前，对于鸡传染性支气管炎的预防免疫接种，最常用的是传统的灭活苗和弱毒苗。灭活苗起效慢，免疫保护期短，存在灭活不当造成疾病传播，且免疫途径多为肌注，不能引起有效地粘膜免疫，影响免疫效果。弱毒苗的优点在于活病毒感染刺激产生局部免疫，很快起到保护作用，且弱毒苗通常以感染鸡胚尿囊液的冻干制品出售，较便宜，容易使用，适于大群体应用。另外，粘膜免疫是近年来免疫学领域的前沿方向和研究热点。因粘膜免疫系统覆盖了机体呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道等400m2的粘膜表面，集中了一半以上的淋巴组织以及80%以上免疫细胞，因此在机体的免疫系统中占有非常重要的地位，且在粘膜病原体感染的早期预防和减轻后续病损中的作用更为关键。因此诱生高水平粘膜免疫应答，在感染早期和初始部位彻底清除病原体，对于预防感染性疾病的发生具有十分重要的意义，而能否引起有效的粘膜免 疫反应也应成为评价疫苗免疫效果的一个重要指标。与灭活苗的肌肉注射的给药方式相比，弱毒苗的口服或滴鼻的给药途径不仅可激发机体免疫系统在血清中产生抗体，而且能够刺激机体产生粘膜免疫反应；另外，与口服、鼻腔给药相比，注射给药方式也存在着不够方便、组织刺激性、成本高等不足。但是，口服、鼻腔接种弱毒苗，虽然可以引起粘膜系统的免疫反应，但也容易在胃肠道中被粘膜纤毛清除和破坏，与粘膜表面的作用时间较短，导致引起的免疫效果较差。因而，为了更好的达到免疫效果，弱毒苗也需要辅以合适的递送系统。递送系统的应用一方面可以保护抗原免受粘膜系统对抗原结构的破坏，使抗原更好的保有其免疫原性；另一方面，也可改变抗原与粘膜系统受体细胞的作用方式，延长作用时间，增强抗原提呈作用。而这些也是粘膜递送系统的主要作用。目前，能达成这两个主要目的的最成功的例子就是以纳米粒或微球的方式。用于制备纳米粒或微球的材料有很多种，包括，明胶、PLGA、PMA、壳聚糖及其衍生物等。壳聚糖因其无毒、良好的生物相容性和生物可降解性而被广泛应用，但是由于其弱的溶解性的限制(仅溶于pH小于6.5的溶液中，而在碱性和中性条件下溶解能力极差，也就是说在生理pH下，壳聚糖的溶解效果很差)，使其作为纳米粒递送系统的应用有一定的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法。本专利技术鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法按以下的实验步骤实现:一、取50 400 μ I IBV Η120系病毒液加入无菌去离子水补足至2mL，然后加入到5mL浓度为0.5 2.0mg/mL的过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中，然后在室温、无菌条件下以搅拌速度为300r/min的条件下搅拌5min,得到混合溶液A ；二、将混合溶液A在室温、无菌条件下以900r/min 1300r/min速度搅拌Imin后，然后滴加2mL浓度为0.75 1. 75mg/mL的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖溶液；然后在搅拌速度不变的条件下磁力搅拌20min 50min,得到混合溶液B ；三、将混合溶液B于4°C、12000r/min离心20min，去上清，并用温度为4°C的无菌去离子水洗涤沉淀3遍，收集固相物；四、将固相物加入到4°C的无菌去离子水中，再加入质量浓度为5%的蔗糖脱脂乳溶液，真空冷冻干燥24h，得到鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，即完成鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法；其中步骤一中IBV H120系病毒液为经过浓缩纯化后的鸡传染性支气管炎H120系病毒液，病毒含量为IO6 5EID5tlA).1mL;步骤四中4°C的无菌去离子水与质量浓度为5%的蔗糖脱脂乳溶液的体积比为1:1。本专利技术采用壳聚糖的季铵盐衍生物——N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(N-2-HACC)和N，O-羧甲基壳聚糖(CMC)为载体，以鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗为控型药物，制备鸡传染性支气管炎活苗纳米粒。与传统疫苗相比，其优势在于稳定性强、释药时间长；同时，在保证疫苗作用的前提下，减少了给药剂量，减轻或避免了毒副反应，延长了免疫保护期，避免多次反复给药，且N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖在pH为I 14时都具有良好的溶解性，载体材料本身无毒并具有一定的抗菌效果，生物相容性好，可生物降解，可通过体内的水解或酶解反应，最终降解为水和CO2，被机体吸收或排出体外。本试验制备的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗可经滴鼻和口服途径提高机体免疫力，延长疫苗在鸡体内作用时间，减少免疫次数，同时N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(N-2-HACC)在pHl 14时均有良好的溶解性，本专利技术制备的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗可用于鸡传染性支气管炎免疫，经滴鼻给药，IBV-N-2-HACC/CMC-NPs (500羽/瓶)，20倍稀释，给药量为每只鸡 0.04mL。同时本专利技术的制备方法具有以下优点:一、本专利技术所使用的N-2-HACC和CMC溶液均为过滤除菌后溶液，为后续的病毒检测和实际应用在源头上减少了杂菌污染；二、加入一定量病毒液后用无菌水补足2mL,使得不同体积的病毒加入后不影响整个反应体系,使条件的摸索更精确；三、N-2-HACC溶液与病毒液的混合速度为300r/min，时间为5min，速度不高是防止病毒在包封前产生损伤(如纤突的脱落)，影响免疫原性；时间长是为了使两者混合更均匀，从而使制备的纳米粒的粒径更均一；四、混合完成后即升至搅拌速度，并于Imin后匀速缓慢滴加CMC溶液，并给与充分的反应时间20_50min，从而形成更多、更均一的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs ;五、用预冷的(4°C )无菌去离子水洗涤沉淀，是为了防止在洗涤过程中部分病毒从纳米粒中释放，并且低温的环境也有益于保持IBV的免疫原性；六、加入5%蔗糖脱脂乳可以更好的保护纳米粒，防止其在真空冷冻干燥的过程中受到损伤。附图说明图1是试验I制备的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的释放曲线图；图2是试验I制备的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的透射电镜图；图3是试验I制备的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的粒径分布图；图4是试验I制备的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的Zeta电位图。具体实施例方式具体实施方式一:本实施方式鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳本文档来自技高网...
【技术保护点】
鸡传染性支气管炎N?2?羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法，其特征在于鸡传染性支气管炎N?2?羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法按以下的实验步骤实现：一、取50～400μl?IBV?H120系病毒液加入无菌去离子水补足至2mL，然后加入到5mL浓度为0.5～2.0mg/mL的过滤除菌后的N?2?羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中，然后在室温、无菌条件下以搅拌速度为300r/min的条件下搅拌5min，得到混合溶液A；二、将混合溶液A在室温、无菌条件下以900r/min～1300r/min速度搅拌1min后，然后滴加2mL浓度为0.75～1.75mg/mL的过滤除菌后的N，O?羧甲基壳聚糖溶液；然后在搅拌速度不变的条件下磁力搅拌20min～50min，得到混合溶液B；三、将混合溶液B于4℃、12000r/min离心20min，去上清，并用温度为4℃的无菌去离子水洗涤沉淀3遍，收集固相物；四、将固相物加入到4℃的无菌去离子水中，再加入质量浓度为5％的蔗糖脱脂乳溶液，真空冷冻干燥24h，得到鸡传染性支气管炎N?2?羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，即完成鸡传染性支气管炎N?2?羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法；其中步骤一中IBV?H120系病毒液为经过浓缩纯化后的鸡传染性支气管炎H120系病毒液，病毒含量为106.5EID50/0.1mL；步骤四中4℃的无菌去离子水与质量浓度为5％的蔗糖脱脂乳溶液的体积比为1∶1。...
【技术特征摘要】
1.鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法，其特征在于鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法按以下的实验步骤实现: 一、取50 400μ I IBV Η120系病毒液加入无菌去离子水补足至2mL,然后加入到5mL浓度为0.5 2.0mg/mL的过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中，然后在室温、无菌条件下以搅拌速度为300r/min的条件下搅拌5min,得到混合溶液A ； 二、将混合溶液A在室温、无菌条件下以900r/min 1300r/min速度搅拌Imin后,然后滴加2mL浓度为0.75 1.75mg/mL的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖溶液；然后在搅拌速度不变的条件下磁力搅拌20min 50min,得到混合溶液B ； 三、将混合溶液B于4°C、12000r/min离心20min，去上清，并用温度为4°C的无菌去离子水洗涤沉淀3遍，收集固相物； 四、将固相物加入到4°C的无菌去离子水中，再加入质量浓度为5%的蔗糖脱脂乳溶液，真空冷冻干燥24h，得到鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，即完成鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法；其 中步骤一中IBV H120系病毒液为经过浓缩纯化后的鸡传染性支气管炎H120系病毒液，病毒含量为IO6 5EID5tlA).1mL;步骤四中4°C的无菌去离子水与质量浓度为5%的蔗糖脱脂乳溶液的体积比为1:1。2.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤一和步骤二所述的过滤除菌的方法为:在无菌操作台中通过0.22 μ m的细菌滤器进行过滤。3.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵凯，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：
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