本发明专利技术提供一种使用利用共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法来观测发光粒子的偏振特性的方法。在本发明专利技术的观测发光粒子的偏振特性的光分析技术中，一边通过变更显微镜的光学系统的光路使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边向光检测区域照射由预先决定的偏振光成分构成的激励光并且检测来自光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度，在检测出的至少一个偏振光成分的强度中个别检测发光粒子的各个信号，根据检测出的发光粒子的信号的至少一个偏振光成分的强度来估算发光粒子的偏振特性值。由此，能够观测样本溶液中的浓度或数密度低的发光粒子的偏振特性。
Optical analysis apparatus for observing polarization characteristics of single light emitting particles, optical analysis method, and computer program for optical analysis
The present invention provides a method for observing the polarization properties of luminescent particles by using a scanning molecular counting method using a confocal microscope or a multiphoton microscope. The polarization characteristics of luminescent particles observed in the invention of the optical analysis technology, while through the optical path of the light microscope changes the detection area of the optical system in the mobile location within the sample solution, to the side light detection region irradiated by polarized light component composed of predetermined excitation light and detecting at least one polarized light component from the optical detection region of the light intensity of the signal, each individual detection of luminescent particles in at least one polarized light component of the detected intensity, according to the strength of at least one polarized light component of the detected signal emitting particles to estimate the value of the polarization properties of luminescent particles. Thus, it is possible to observe the polarization properties of the luminescent particles in the sample solution with a concentration or a low number density.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及如下一种光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序:能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等可检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统个别检测来自单个发光的粒子的光并进行各种光分析的技术。此外，在本说明书中，发出光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发出光的粒子以及附加了任意的发光标识或发光探针的粒子中的任意一个，从发光粒子发出的光可以是通过照射激励光而发出的萤光、磷光等。
技术介绍
由于近年来的光计量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或萤光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的计量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在萤光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如参照专利文献 1-3、非专利文献 1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的萤光强度，根据由测量得到的该萤光强度的自相关函数的值所决定的在微小区域内的萤光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留的分子的个数的平均值，获取萤光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在萤光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如专利文献 4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地计量出的出入共焦区组织内的萤光分子等的萤光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算萤光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。并且，在FIDA中还能够通过偏振光成分将所检测的荧光分开来以两个通道进行解析，由此求出作为对象的分子的偏振特性(Fluorescence IntensityDistribution Analysis-Polarization:FIDA_P0)(非专利文献 5)。在 FIDA-P0 中，分别生成突光的P偏振光成分(水平偏振光成分)和s偏振光成分(垂直偏振光成分)的强度的直方图，根据通过使统计性的模型公式拟合这些直方图的分布而计算出的荧光分子等的各偏振光成分的强度的平均值来估算荧光分子等的偏振度。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统计量出的样本溶液的萤光信号的时间经过来检测萤光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术计量来自流通于流式细胞仪的萤光微粒子或固定在基板上的萤光微粒子的微弱光，来检测流中或基板上的萤光微粒子的存在。特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的萤光测量技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十UL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中多次反复进行秒级时间的计量)。因而，这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，期待成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。专利文献1:日本特开2005-098876专利文献2:日本特开2008-292371专利文献3:日本特开2009-281831专利文献4:专利第4023523号专利文献5:国际公开2008-080417专利文献6:日本特开2007-20565专利文献7:日本特开2008-116440专利文献8:日本特开平4-337446号公报報非专利文献1:金城政孝、蛋白质核酸酶Vol.44，N0.9，1431-1438页1999年非专利文献2:F.J.Meyer-Alms> 突光相关谱(Fluorescence CorrelationSpectroscopy)、R.Rigler 编，Springer,柏林，2000 年，204-224 页非专利文献3:加藤则子及其他4名，遗传医学，Vol.6，N0.2，271-277页非专利文献4:卡斯柯(Kask)及其他3名，美国科学学院纪要，1999年，96卷，13756-13761 页(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))非专利文献5:卡斯柯(Kask)及其他6名，生物物理杂志，2000年，78卷，1703页(P.Kask, K.Palo, N.Fay, L.Brand, U.Mets, D.Ullmann, and J.Jungmann:Biophys.J.78，1703(2000))
技术实现思路
专利技术要解决的问题在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光分析技术中，所计量的光是从萤光单分子或多分子发出的光，在该光的解析中执行按时间序列测量出的萤光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的萤光强度的波动的计算等统计性的处理，并非个别地参照或分析来自各个萤光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个萤光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对萤光分子等检测统计平均性的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，样本溶液中的作为观测对象的萤光分子等的浓度或数密度需要是在平衡状态下在一次的秒级长度的计量时间内能够进行统计性的处理的个数的萤光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的萤光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为IfL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的萤光分子等的浓度典型的是InM左右或其以上，在大幅低于InM时，产生在共焦区组织内不存在萤光分子等的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6 8所记载的萤光分子等的检测方法中，不包括萤光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的萤光分子等小于InM也能够对萤光分子等进行检测，但无法达成定量地计算出在溶液中随机运动的萤光分子等的浓度或数密度。因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的光分析技术，能够定量地观测作为观测对象的发光粒子的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：山口光城，田边哲也，
申请(专利权)人：奥林巴斯株式会社，
类型：
国别省市：
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