本发明专利技术涉及土壤微生物、生物化学及分子生物学等领域，特别是从新疆不同连作年限棉田土壤中分离纯化出土壤微生物30kb-150kb大片段DNA，并连接到适合的载体中构建成宏基因组文库，该文库中包含有不同连作年限棉田土壤中原核和真核微生物各种染色体内部基因信息。本发明专利技术针对新疆连作棉田中孕育的大量生物基因资源，利用现代分子生物技术手段从不同连作年限棉田土壤中分离微生物大片段DNA并连接到宏基因组载体当中，在未培养的情况下直接获得了各种连作年限棉田土壤生态环境中各种微生物基因资源。该文库可用于筛选各种不同连作年限棉田微生物资源基因和研究生物基因调控原理等。
Construction of a continuous cropping cotton soil metagenomic library
The invention relates to the field of Soil Microbiology, biochemistry and molecular biology, especially the purification of soil microbial 30kb-150kb large DNA fragment isolated from Xinjiang in continuous cropping cotton field soil, and connected to the suitable carrier in the construction of a metagenomic library, the library contains different years of continuous cropping cotton soil prokaryotic and eukaryotic microorganism variety within the chromosome of genetic information. The present invention for a large number of biological gene resources for breeding Xinjiang continuous cropping cotton field, the use of modern molecular biology techniques microorganisms isolated from the large fragment of DNA from soil in continuous cropping cotton field and connected to the metagenomic carrier, without training directly without access to a variety of microbial resources all kinds of continuous cropping cotton soil ecological environment. The library can be used to screen the genes of microbial resources in different cotton growing years and to study the principles of biological gene regulation.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及土壤微生物、生物化学及分子生物学等领域，特别是把从新疆不同连作年限棉田土壤中分离纯化出土壤微生物30kb-150kb大片段的DNA连接到BAC载体中构建成宏基因组文库，该文库中包含有不同连作年限棉田土壤中原核和真核微生物各种染色体内部基因及其调控信息。本专利技术针对新疆连作棉田中孕育的大量生物基因资源，利用现代分子生物技术手段从不同连作年限棉田土壤中分离微生物大片段DNA并连接到宏基因组载体当中，在未培养的情况下直接获得了各种连作年限棉田土壤生态环境中各种微生物基因资源。该文库可用于筛选各种不同连作年限棉田微生物资源基因和研究生物基因调控原理等。
技术介绍
从1929年发现青霉素以来，人们已经从微生物中开发了一百多种临床使用的抗生素，抗癌和抗病毒药物。然而，近些年来人类、家畜以及栽培作物病原菌抗(耐)药性迅速发展，新的传染病隐患日益加深，但是从可培养微生物中发现新型生物活性物质的研究却举步为艰，为此科学家们不断的调整研究的材料以及方法，试图高效而持续的从各种环境中开发出丰富的微生物资源。土壤微生物是最有价值的天然产物来源，它们能提供许多工业上十分重要的抗生素以及生物催化剂。各种微生物都有惊人的产生多样化次级代谢产物的能力。Hammond估计地球上的微生物物种多达16X109，广泛分布于各种生态系统中，其中，土壤无论从微生物数量和种类上都是首屈一指的生境。有人用科学的方法估计I克土壤中约有大于10000种不同的微生物，因此，土壤是微生物的大本营。但是，运用现有的技术，只有0.2% 2%的土壤微生物是可培养的，因此土壤中孕育着大量未被开发的生物基因资源。利用土壤环境下的未培养微生物资源是工 业生物技术开发的一个全新领域，也是人类寻找新型功能活性物质和天然药物的天然宝库，具有广阔的开发应用前景。过去十多年在环境微生物培养和高新生物技术上的发展，特别是在基因组相关技术上的飞速发展，为我们从分子水平上了解环境微生物及其生态功能多样性提供了诸多的便利。首先:随着基因组技术的发展，人们开始用分子生物学的方法来研究微生物间的进化关系和遗传信息的功能关系。环境基因组又称多源基因组或宏基因组，是指从环境中提取总的DNA，对其进行遗传学和功能学的研究。优点是不但可以原始地反映环境样品中所有生物的遗传多样性，避开难培养这一技术瓶颈，而且可以把细胞外的DNA—并研究。通过环境基因组的方法可以获得越来越多的DNA序列，且大都是新颖的未被纯培养微生物的序列。运用环境基因组序列不但可以使我们逐渐了解微生物群落功能的复杂性，以及微生物间的相互作用关系，而且可以使我们深入了解未被纯培养微生物的生理和生态特征。研究药物发现相关的新颖基因，自然也要把目标锁定在环境基因组中编码新颖次级代谢产物的基因上。与其他基因工程技术不同，土壤环境基因组技术所需要的DNA片段不是来自已知菌中已熟知的基因片段或基因簇，而是来自完全未知的土壤样品中，对其可能具有的潜在功能也并不知晓。在土壤总DNA中，编码次级代谢产物的基因经常是成簇存在的，与同一个次级代谢产物相关的基因的生物合成区域和调节区域经常是紧密相连的。这些相连的基因使得克隆到载体中整个次级代谢产物途径基因是一个连续的片段。在药物发现中，生物合成基因和抗性基因也是连在一个片段上的，对于有毒的代谢产物，宿主可以通过共表达的抗性基因带来的抗性机制来避免毒性。这一特点不但简化了对外源片段进行剪切和修饰程序，而且使重组子的筛选更加方便，无疑为功能基因的克隆和表达提供了便利。其次:宏基因组(metagenomics)工程,直接将特定环境中的总体遗传物质，克隆到可培养的宿主细胞中，建立宏基因组文库，从所获得的重组克隆子中筛选活性物质和相关基因(簇)，避开了环境微生物分离培养的难题，在挖掘和利用未培养微生物资源，筛选新颖生物活性物质方面具有极大的潜力。随着对各种生物在DNA分子水平上研究的深入，尤其是人类和水稻基因组计划的实施，构建基因组文库己成为遗传研究实验室的常规策略。它对于分离特定的基因片段，研究基因的表达调控、基因组的组织结构，以及人类和动植物的基因组工程等都有极其重要的作用。构建基因组文库的载体很多，大致可分为噬菌体系列(如早期的噬菌体、COS-mid、PI噬菌体和fosmid等)和 人工染色体系列(如YAC、BAC和PAC等)。前者的克隆能力相对较小(噬菌体24kb左右，cosmid 35 45kb)，许多真核生物的基因，上游启动子序列较长，又含有大而多的内元，如此庞大而复杂的结构，难以作为单一片段克隆于这些载体中。因此，人们开始构建一系列的人工染色体，如酵母人工染色体(yeastartificialchromosome, YAC)、细菌人工染色体(bacterialartif icialchromosome, BAC), Pl 人工染色体(Pl-de-rived artificial chromosome, PAC)和哺乳动物人工染色体(mammalianartificial chromosome,MAC)等,它们的普遍特点是插入片段较大,一般在IOOkb以上。这些具有较大外源片段承受能力的人工染色体对于真核生物基因组文库构建无疑是极为有利的，且其在与外源片段连接后无需进行包装。新疆干旱地区是我国粮棉瓜果生产的重要基地。到2010年它已连续18年成为我国最大产棉区，仅2006年种植棉花面积已达1864万亩,耕种面积占到各类农作物总面积近40%，在宜棉区的棉花播种面积甚至高达90%以上。像新疆这样的农业大省，多年来由于连作(有的长达20年以上)、作物品种单一等多种原因造成作物病虫害日渐加重并有爆发的趋势，而为了控制病虫害的蔓延农药被大量使用，随之而来的是土壤被严重污染，据报道新疆仅仅棉花每年平均施药在十次以上。有毒物质的常年累积反过来又造成农田生物多样性趋向单一，同时快速提高了病原菌的耐药性和抗药性，也就是说如此的恶性循环导致了一个非常突出的现象——农作物的主栽区往往也是病虫害的重灾区，也是农药、化肥、地膜等污染的重灾区。但是，另一方面随着棉花种植面积的不断扩大，连茬现象越来越严重，我们也清楚的观察到两个可惜的现象。一个是，滴灌技术的运用使大量荒地被开垦，而在新开垦的棉花地几乎没有任何病害发生(即便是和发病严重的棉花地相邻)，也就根本无需依靠农药来杀灭病害，而造成这种现象的根本原因是新开垦的土壤微生物原生态结构还未发生大的改变、微生物多样性还未被完全破坏，从而表现出来的土壤生态结构与功能的一致性。另一个是，连年耕作给土壤微生物生态带来负面影响的同时，也起到了富集具有降解农业污染物和转化难利用物质功能的微生物的作用，那么这些微生物必然也具有一些可以开发和利用的资源基因。因此该地区土壤中可能蕴含着新的、还不为人知的基因资源。通过构建，对不同类型、不同耕作方式下的微生物群落结构进行研究，能揭示出微生物群落结构与理化性质的内在联系，从而改善当前的生态环境，并获得新的、有用的基因资源。本专利技术就是针对不同连作年限棉田土壤中蕴含的大量微生物基因组信息，利用土壤大片段DNA提取技术和BAC载体，通过构建宏基因组文库的方式直接获得了包括非培养微生物基因组信息在内的所有的土壤生物信息。该文库的构建能本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个构建的包含有未耕作土壤在内的不同连作年限棉田土壤宏基因组文库。首先分离获得各种不同连作年限的棉田土壤微生物细胞，然后利用低熔点琼脂糖包埋法经脉冲电泳分离各种大小的DNA片段，最后将回收到的30?150kb大小的DNA片段与BAC载体连接并克隆到大肠杆菌宿主菌中，超过10万个这样的克隆构建成一个土壤宏基因组文库。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，
申请(专利权)人：新疆师范大学，
类型：发明
国别省市：
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