病毒性出血败血症病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种病毒性出血败血症病毒的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。检测引物组包括外引物、内引物和环引物；检测试剂盒主要包括引物液、反应液、DNA聚合酶、逆转录酶和对照；其检测方法是通过提取待检病毒RNA，利用逆转录酶的逆转录活性，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，对样品RNA模板进行扩增，可检测到纯病毒RNA的pg级，其鉴定采用加入SYBR?Green?I?ESE-Quant-tube?Scanner仪器检测或者利用浊度仪，确定待检样品是否含有病毒性出血败血症病毒RNA。本发明专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。

RT-LAMP detection primer set, kit and detection method for viral hemorrhagic septicemia virus

The invention belongs to the technical field of molecular biology, and relates to a detection method of marine aquaculture industry, in particular to a RT-LAMP detection primer set, a detection reagent kit and a detection method for viral hemorrhagic septicemia virus. Primers group including outer primers and inner primers and loop primers; detection kit including primer liquid, reaction liquid, DNA polymerase, reverse transcriptase and control; the detection method is tested by extracting virus RNA, reverse transcriptase reverse transcriptase activity by using six specific primers and a strand displacement activity the sample RNA DNA polymerase, template for amplification, PG can detect pure virus RNA, identified by adding SYBR? Green? I? ESE-Quant-tube? Scanner testing or using turbidimeter, determine whether the sample containing viral haemorrhagic septicemia virus RNA. The invention has the advantages of high speed, high efficiency, simple operation, high specificity, high sensitivity, simple and convenient identification, etc..

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种病毒性出血败血症病毒(VHSV)的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
病毒性出血性败血症(VHS)是一种能感染各种年龄的鲑鳟鱼和各种能自由生活的海鱼(如鳕、鲱、鳎、鮰、白斑狗鱼和大菱鲆、牙鲆等)的致死性的、全身性传染病。通常在冬末春初和水温8 10°C时流行，水温上升到15°C以上，发病率降低。该病流行于整个欧洲大陆、北美和日本，传染性极强，发病渔场的每升水中有1000个病毒。病毒性出血性败血症的主要特征是出血，自然条件下本病潜伏期为7-25天。因症状缓急及表现差异，分急性型、慢性型和神经型三种类型。病毒性出血败血症病毒可以通过病鱼或带毒鱼的排泄物、卵子、精液等排出病毒，在水体中扩散传播，病毒经鱼鳃侵入鱼体而感染。病鱼表现为无目的地漂游，身体发黑，皮肤和鳃渗血溃疡；眼球突出，肛门红肿，腹部肿大。剖检可见大量溶血腹水；肠、心、肾、鳔有时连同肌肉也出血，内脏水肿。VHS的病原是病毒性出血性败血症病毒(VHSV),属于弹状病毒科Novirhabdovirus属。病毒基因组为一段单链负链RNA，其线性基因组编码5个蛋白包括:核衣壳蛋白(N蛋白)，两个结构蛋白(Ml和M2蛋白)，糖蛋白(G蛋白)和RNA聚合酶(L蛋白)。VHSV粒子长约180nm，宽约70nm。其基因组长度约12k个碱基。培养分离病毒性出血败血症病毒一般需要15天以上才能得出结果，检测周期太长，不适应口岸快速检测和大通关的时代要求。因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。 基于一种新的恒温核酸扩增法(loop-mediatedisothermal amplification ofDNA,简称LAMP)技术的基因检测正是很好的解决了目前基因检测的弊端。LAMP技术利用Bst DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应。在LAMP反应中，内引物杂交在目标DNA区,启动互补链合成，导致哑铃状DNA产生。这种结构很快以自身为模板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，这个茎-环结构DNA作为LAMP循环的起始结构。由于内引物杂交在茎_环的环上，引物链置换合成的DNA产生一个有缺口的茎-环DNA中间媒介，在茎上附有目标序列。再通过外引物，在茎的末端形成环状结构，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。RT-LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。而且不需要特殊的试剂和仪器设备，因此绝对可以建立起总成本低廉的检测体系。该方法适用于现场检测和大量样品高通量检测，在临床疾病诊断，基因芯片开发及食品卫生质量检验等领域具有广阔的应用前景。通过将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种病毒性出血败血症病毒的RT-LAMP检测引物组。本专利技术的另一个目的在于提供一种病毒性出血败血症病毒的RT-LAMP检测试剂盒。本专利技术的另一个目的在于提供病毒性出血败血症病毒的RT-LAMP检测方法。本专利技术所采用的技术方案如下:一种病毒性出血败血症病毒(VHSV)的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物VHSV-F3 和 VHSV-B3、一对内引物 VHSV-FIP 和 VHSV-BIP、一对环引物 VHSV-LF 和 VHSV-LB，其核苷酸序列分别如下所示:VHSV-F3: TTATCTCAACCATCTCATCACC (SEQ ID NO:1);VHSV-B3:TGATGCTGACTACTGCCT (SEQ ID NO:2);VHSV-FIP:GGATATTTTCCCAGAAGCGGTGCATGGCTCAAAGAACCG (SEQ ID NO:3);VHSV-BIP:TCTCAAAGTTTCGTCCCAGCCCAGTCACCTCGCATGATT (SEQ ID N0:4)；VHSV-LF:CACTATGGGCA TCTAGGCAC (SEQ ID NO:5);VHSV-LB:CACACTATCTTCTCAACGGTCA (SEQ ID NO:6)。一种病毒性出血败血症病毒(VHSV)的RT-LAMP检测试剂盒,其包括权利要求1所述的RT-LAMP检测引物组。一种病毒性出血败血症病毒(VHSV)的RT-LAMP检测试剂盒，包括以下成分:所述的RT-LAMP检测引物组、逆转录酶、DNA聚合酶、RT-LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。较佳地，所述检测试剂盒中，所述引物组中外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:8:4。较佳地,所述检测试剂盒中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述逆转录酶为AMV逆转录酶。较佳地，所述检测试剂盒中，所述RT-LAMP反应液含有:10mM dNTP、IOXThermoPol反应缓冲液、150mM MgSOyjC溶液，三者的体积比是8: 5: 2。较佳地，所述检测试剂盒中，所述阳性对照为含有病毒性出血败血症病毒(VHSV)囊膜糖蛋白基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC水。本专利技术的检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为荧光染料SYBR Green1利用上述的试剂盒检测病毒性出血败血症病毒(VHSV)的方法，包括如下步骤(I )、待检样品RNA的提取:采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA ；(2)、恒温基因扩增反应:25μ I反应体系含有:VHSV-F30.2 μ M，VHSV-B30.2 μ Μ，VHSV-FIP1.6 μ Μ, VHSV-BIP1.6 μ Μ, VHSV-LF0.8 μ Μ, VHSV-LB0.8 μ Μ, RT-LAMP 反应液12.5 μ 1，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNAl lOOng，用DEPC水补齐到25 μ I ;设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63 65°C反应60 90min，并在80°C 持续 2min ；(3)、结果判断:通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。在试剂盒中含有显色剂的情况下，往反应管中加入10XSYBR Green 10.5μ1，然后将反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner中，根据仪器所实时读取的荧光信号来判断扩增结果。本专利技术根据病毒性出血败血症病毒(VHSV)的囊膜糖蛋白基因(gly G基因，GenBank登录号为DQ401190.1)设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；使得本专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果:(I)、快速高效:整个扩增只用60 90min即可完成，扩增产量可达IO9 101°个拷贝；(2)、操作简便:不需要复本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种病毒性出血败血症病毒的RT?LAMP检测引物组，包括一对外引物VHSV?F3和VHSV?B3、一对内引物VHSV?FIP和VHSV?BIP、一对环引物VHSV?LF和VHSV?LB，其核苷酸序列分别如下所示：VHSV?F3：TTATCTCAACCATCTCATCACC；VHSV?B3：TGATGCTGACTACTGCCT；VHSV?FIP：GGATATTTTCCCAGAAGCGGTGCATGGCTCAAAGAACCG；VHSV?BIP：TCTCAAAGTTTCGTCCCAGCCCAGTCACCTCGCATGATT；VHSV?LF：CACTATGGGCATCTAGGCAC；VHSV?LB：CACACTATCTTCTCAACGGTCA。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈进会，黄伟，邱杨，刘建丽，赵丽，王学松，
申请(专利权)人：东莞出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，
类型：发明
国别省市：