转基因甜菜H7-1的LAMP现场快速检测方法技术

本发明专利技术涉及转基因甜菜H7-1的检测方法和试剂盒。经过比较筛选，找到了针对转基因甜菜H7-1特异性良好的LAMP引物，所述引物针对含有转基因甜菜H7-1以外的DNA不发生特异性扩增。本发明专利技术的方法可良好地应用于鉴定转基因甜菜H7-1成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。

LAMP field rapid detection method for transgenic beet H7-1

The invention relates to a method and a kit for detecting transgenic beet H7-1. After the comparison and screening, we found the LAMP primers with good specificity for the transgenic beet H7-1, and the primers did not produce specific amplification of DNA in addition to the transgenic beet H7-1. The method of the invention can be applied to the identification of the H7-1 component of the transgenic beet, and has good reproducibility and sensitivity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和核酸检测
具体地，本专利技术涉及转基因甜菜H7-1的检测方法和试剂盒。
技术介绍
1998年，转基因甜菜首次被批准商业化种植。至今，转基因甜菜已经在美国、加拿大、新西兰、澳大利亚等国被批准种植。2009年，美国转基因甜菜的种植面积占全国甜菜种植面积的95%。甜菜是加工白糖的主要原料，占白糖加工原料的1/3 ;其副产品有糖蜜和甜菜柏，均可用于食品和饲料。甜菜肉柏是食用纤维的主要原料之一，被广泛应用于食品加工行业。甜菜柏也被广泛用于养猪、养牛业的饲料，尤其是奶牛养殖业的首选优质饲料。世界各国对转基因生物的安全性问题争议较大，欧盟、日本、韩国、中国等国家出台了转基因产品标签制度及相关法规，要求对转基因产品进行强制性标识。2006年，日本发布“关于转基因食品质量标签标准的修正草案”，要求对糖用甜菜及以糖用甜菜作为主要配料的加工食品强制性标识转基因成分。现在出口商要求出口到欧盟、日本等国的白糖、甜菜柏等甜菜加工产品，要求出具非转基因检测证书。所以，检验检疫口岸急需转基因甜菜的检测标准方法，以促进出口和保护我国利益。目前大面积种植的是抗草甘膦甜菜H7-1。转基因甜菜H7-1是Monsanto公司产品，美国2004年，菲律宾2005年被批准食用；该品系改变的性状为耐除草剂，所含外源基因有:FMV35s、E93\ cp4epsps和ctp2。国内外已有转基因甜菜H7-1检测的研究报道，方法主要是PCR方法。PCR方法由于高特异性、高灵敏度被广泛应用，然而本方法只能用于实验室检测，需配置高精尖仪器，操作人员需有专业知识，不适用于现场快速检测。随着贸易发展和企业的现场监控，口岸简易实验室和进出口企业越来越需要现场的、快速的、不需高昂设备仪器和专业人员的检测方 法。当前转基因甜菜H7-1品系的标准检测方法主要依据欧盟规定的方法。甜菜H7-1品系标准检测方法的文献依据是欧盟发布的官方方法“CRLVL28/04VP Event-specificMethod for the Quantitation of sugar beet line H7_lUsing Real-timePCR (Corrected versionl) ”,该方法采用的是TaqMan实时突光PCR方法,检测转入事件与甜菜基因组结合点区域。但是，这种方法都需要高端仪器设备、专业操作人员。本领域目前还没有检测效果良好且操作简单、设备要求低的特异性检测转基因甜菜成分的试剂和方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供转基因甜菜H7-1的检测方法和试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供一种鉴定转基因甜菜H7-1成分的方法，所述方法包括:以待测样品的DNA为模板，以特异性扩增转基因甜菜H7-1的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因甜菜H7-1成分；其中，所述的特异性扩增转基因甜菜H7-1的引物包括:上游外引物SEQ ID N0:1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQID N0:3，下游内引物SEQ ID NO: 4，上游环引物SEQ ID NO: 5，下游环引物SEQ ID N0:6。。在一个优选例中，所述的扩增是环介导等温扩增(LAMP)。在另一优选例中，所述的环介导等温扩增包括:63土1°C (较佳地63±0.5V )恒温反应90 土 IOmin (较佳地90 土 5min)，然后在80 ± 2°C (较佳地80 ± I °C )灭活5 土 Imin (较佳地5±0.5min)，结束反应。在另一优选例中，所述的环介导等温扩增的体系中包括弓I物、Mg2+、甜菜碱、dNTPs ；其中，Mg2+浓度8± ImM ;甜菜碱浓度1±0.1M ;dNTPs浓度1.6±0.2mM。在另一优选 例中，在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中加入SYBR GreenI荧光染料观察颜色变化，没有扩增产物的阴性管呈橙色，有扩增产物的阳性管为绿色在另一优选例中，所述的待测样品是种子、食品或饲料。在本专利技术的另一方面，提供一种引物，所述引物是LAMP扩增引物，包括:上游外引物SEQ ID NO: 1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQ ID NO:3，下游内引物SEQ IDN0:4，上游环引物SEQ ID N0:5，下游环引物SEQ ID N0:6。在本专利技术的另一方面，提供所述的引物的用途，用于从待测样品中鉴定转基因甜菜H7-1成分。在本专利技术的另一方面，提供一种鉴定转基因甜菜H7-1成分的试剂盒，其中包括前面所述的引物。在一个优选例中，所述试剂盒中还包括:含有转基因甜菜H7-1成分的检测标准品；DNA提取试剂；pH 缓冲试剂(如 Tris-HCl (PH8.8))；钾离子溶液；镁离子溶液；铵离子溶液；Tween20 ；甜菜碱；dNTP ；Bst大片段DNA聚合酶；荧光染料(如SYBR Green I荧光染料);和/或说明鉴定转基因甜菜H7-1成分的方法的使用说明书。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、LAMP弓丨物的LAMP反应结果。 CH5-6:阴性对照，CH7-8:阳性对照。图2、LAMP引物引入环引物的LAMP反应结果。CH1-2:阴性对照，CH3-4:阳性对照。图3、引物特异性图。A:CHl-8依次为:转基因甜菜H7-1，转基因棉花M0N531，转基因大豆M0N89788，转基因大米Bt63，转基因油菜MS8XRF3，转基因玉米GA21，转基因玉米M0N810，转基因玉米Mon863 XMon810。B:CHl-8依次为:转基因玉米M0N863，转基因玉米M0N88017，转基因玉米NK603，转基因玉米MIR604，转基因玉米M0N89034，转基因玉米CBH351，转基因玉米B11，转基因玉米 BT176。C:CHl-8依次为:转基因玉米EVENT98140，转基因马铃薯EH92-527-1，转基因大豆DP305423，转基因大豆DP356043，转基因大豆GTS40-3-2，转基因大米科丰6号，转基因大米科丰8号，转基因油菜GT73。图4、LAMP引物的灵敏度。CHl:100% ；CH2:5% ；CH3:1% ；CH4:0.5% ；CH5:0.1% ；CH6:阴性对照(超纯水)。图5、5%模拟样品稳定性实验图。A =CHl:阳性对照，CH2:阴性对照(超纯水)，CH3-8:5%转基因甜菜H7-1模拟样品OB:CHl-8:5%转基因甜菜H7-1模拟样品。C:CHl-6:5%转基因甜菜H7-1模拟样品。`图6、1%模拟样品稳定性实验图。A:CHl-8:1%转基因甜菜H7-1模拟样品。B:CHl-8:1%转基因甜菜H7-1模拟样品。C =CHl:阳性对照，CH2:阴性对照，CH3-6:1%转基因甜菜H7_l模拟样品。图7、0%空白样品稳定性实验图。A =CHl:阳性对照，CH2:阴性对照，CH3-8:0%转基因甜菜H7-1样品。B:CHl-8:0%转基因甜菜H7-1样品。C:CHl-6:0%转基因甜菜H7-1样品。图8、转基因甜菜H7-1品系5%模拟样品的LAMP显色法检测结果。图中第一排第一管为阳性对照，第二管为阴性对照，其余为5%模拟样品。阴性对照以无本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定转基因甜菜H7?1成分的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以特异性扩增转基因甜菜H7?1的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因甜菜H7?1成分；其中，所述的特异性扩增转基因甜菜H7?1的引物包括：上游外引物SEQ?ID?NO:1，下游外引物SEQ?ID?NO:2，上游内引物EQ?ID?NO:3，下游内引物SEQ?ID?NO:4，上游环引物SEQ?ID?NO:5，下游环引物SEQ?ID?NO:6。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张舒亚，周瑶，王涛，张坤，
申请(专利权)人：中华人民共和国上海出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：