本发明专利技术公开了一种脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法，该方法从羊脑多头蚴原头节提取总RNA，采用RT-PCR技术首次扩增出HSP基因序列，该基因的开放阅读框为408bp，编码136个氨基酸。将此基因克隆到pET-32a(+)载体，构建重组表达质粒pET-32a-HSP，经转化大肠杆菌BL21（DE3）后IPTG诱导表达，用SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物；以纯化后的表达蛋白作为抗原，建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法(DIGFA）。本发明专利技术通过分子生物学的方法，人工合成了一种可以用于脑多头蚴病诊断的重组抗原，并评价了该表达蛋白在脑多头蚴病诊断中的应用价值。
Preparation method and application of brain heat shock protein antigen
The invention discloses a method for preparing a brain coenurus heat shock protein, the method of extracting total RNA from sheep coenurus protoscolex, HSP gene sequence was amplified by RT-PCR technique, the gene ORF was 408bp, encoding 136 amino acids. This gene was cloned into pET-32a (+) vector, the recombinant plasmid pET-32a-HSP was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) after IPTG induced expression product with SDS-PAGE and Western-blot to protein detection; the purified recombinant protein as antigen, colloidal gold filtration assay was established to detect ovine coenurosis antibody (DIGFA). In the present invention, a recombinant antigen which can be used in the diagnosis of cerebral multiple disease was synthesized by molecular biology method.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种以热休克(HSP)重组蛋白为抗原，建立动物多头蝴病免疫金标渗滤检测法。
技术介绍
脑多头蝴病(Coenuriasis)又叫脑包虫病，是由带科的多头带绦虫(Taeniamulticeps)的中绦期幼虫-脑多头蝴(Coenurus cerebralis)寄生于绵羊、山羊、黄牛、牦牛和骆驼等有蹄动物的脑和脊髓 等处引起的一种寄生虫病，该病是我国草食动物的常见疾病，每年给畜牧业造成巨大的经济损失。近年来，血清学诊断技术已应用于脑多头蝴病的诊断，但由于所用的诊断抗原主要是包囊囊液、多头蝴原头节和囊壁等虫体天然抗原，它们来源十分有限，不能满足实际的需要。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种以热休克(HSP)重组蛋白为抗原，建立动物多头蝴病免疫金标渗滤检测法，旨在解决血清学诊断技术已应用于脑多头蝴病的诊断，但由于所用的诊断抗原主要是包囊囊液、多头蝴原头节和囊壁等虫体天然抗原，它们来源十分有限，不能满足实际的需要的问题。本专利技术实施例是这样实现的，一种脑多头蝴热休克蛋白抗原的制备方法，该方法从羊脑多头蝴原头节提取总RNA，采用RT-PCR技术首次扩增出HSP基因序列，该基因的开放阅读框为408bp，编码136个氨基酸。将此基因克隆到pET-32a(+)载体，构建重组表达质粒pET-32a-HSP，经转化大肠杆菌 BL21 (DE3)后 IPTG 诱导表达，用 SDS-PAGE 和 Western_blot检测表达产物；以纯化后的表达蛋白作为抗原，建立检测羊脑多头蝴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法(DIGFA)进一步，培养基和常用溶液的配制方法为:利用超纯水配制溶液，用0.22 μ m的过滤器过滤配制好的IPTG溶液；将超纯水800 mL 混合 Yeast Extract5 g, Trypton、10 gNaCllOg,调节 pH 值至7.2，定容至I 000 mL，并于121 °C高压蒸汽灭菌20 min，再置于4°C保存；将琼脂粉加入液体LB培养基，于121°C的高压灭菌锅灭菌20min，最后将琼脂粉的浓度调节为1.5%(w/v);最后在琼脂糖培养基温度降低后加入氨苄青霉素并倒板；利用购买的氨苄青霉素和超纯水配制成工作液浓度100mg/mL，再用0.22 μ m滤器过滤除菌，于_20°C保存备用；将27.5 g、硼酸54g Tris，置于20 mL 0.5 mol/L EDTA溶液，最后加超纯水定容至 I 000 mL ；将Ig琼脂糖粉末置于90mL超纯水，再加入IOmL的5XTBE，定容至IOOmL ；0.8gN, N' 一亚甲叉双丙烯酰胺、29.2g丙烯酰胺溶于适量超纯水中，定容至lOOmL，于4°C避光保存；将18.17gTris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为8.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存；将12.1lg Tris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为6.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存；将IOgSDS干粉溶于80mL的灭菌超纯水中，同过加热溶解干粉，最后定容至10OmT,；将Ig过硫酸铵溶于水中，定容至IOmL ；1.6 mL 双蒸水、2 mL30% 丙烯酸胺、1.5 mol/L Tris (pH8.8)1.3 mL、0% 过硫酸铵0.05 mL、TEMED 0.002 mL、10%SDS 0.05 mL ；10%SDS0.01 mL、0.68 mL 双蒸水、1.0 mol/L Tris(pH6.8)0.13 mL、30% 丙烯酞胺0.17 mL、10% 过硫酸铵 0.01 mL、TEMED 0.001 mL ；取14.4g甘氨酸、3gTris混合IgSDS溶解于超纯水,最后定容至IOOOmL ；缓冲液:将0.1%溴酚蓝、25%甘油、14.4mmol/L 2-巯基乙醇、2%SDS混合于60mmol/LTris-HCl ；将45mL甲醇，45mL水，IOmL冰乙酸，0.25g考马斯亮蓝R-250 ； 90mL 甲醇:水(1:1), IOmL 冰乙酸；将Tris碱5.8g，甘氨酸2.9g，SDS (电泳级)0.37g，甲醇200mL，加去超纯水定容至 IOOOmL ；KH2PO40.24g、Na2HPO4.Η202.9g、0.2gKCl、8.8gNaCl、用超纯水定容至 lOOOmL，并置于高压灭菌锅灭菌后4°C保存备用；将NaC18.8g、lMTris-HCl (pH8.0) 20mL、加入 800mL 超纯水充分搅拌溶解，再加Tween-200.5mL混匀，最后加超纯水定容至IOOOmL,并用高压灭菌锅灭菌后于4°C保存备用；PBSlOmL, BSA0.lg，现配先用；6.0mgDAB, 10mT.0.0lM PBS, I μ L H2O2 ；NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4.12 H2O 3.58 g, KH2PO4 0.27 g 加去离子水溶解并定容至I OOOmL ；在上述PBS中按0.05%加入Tween-20，混匀；含5%FBS 的 0.01 mol/L ρΗ7.4 PBS 溶液；临用前配制0.1 mol/L 柠檬酸(2.1 g/100 mL),0.2 mol/L Na2HPO4.12H20 6.1mL, ddH20 12.5 mL，邻苯二胺 10 mg，溶解后，加入 30%H202 40 μ L ；终止液采用2 mol/L H2SO4。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种利用上述制备方法制备的脑多头蝴热休克蛋白抗原建立检测羊脑多头蝴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法，其特征在于，该重组蛋白胶体金渗滤法包括以下步骤:脑多头蝴总RNA的提取，将保存于液氮的脑包虫原头蝴抽屉总RNA，利用总RNA抽提试剂盒，并按照其说明书进行总RNA抽提；脑多头蝴HSP基因的RT-PCR扩增，根据测序完成的多头带绦虫转录组数据，利用Primer Primer 5.0软件设计一对引物，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列为:上游引物:5，-CGCGGATCCATGGTGAACGATGCAGAGAAGT-3’下游引物:5，-CCGGTCTCCACCTCCTCAATGGT-3，对抽提的RNA，将抽提的脑多头蝴原头节总RNA进行反转录，反应体系同FABP扩增。合成cDNA，加入引物，进行RT-PCR扩增；Tm-HSP基因胶回收、连接、转化，将RT-PCR扩增得到的HSP基因通过胶回收、连接、转化，将其插入入PMD 18-T载体，并且转化入DH5a大肠杆菌进行扩大培养，其具体步骤同Tm-FABP ；pET-32a -Tm-HSP重组质粒的构建及鉴定；pET-32a_HSP重组质粒在大肠杆菌中的表达与鉴定；将鉴定正确的pET-32a_HSP重组质粒转入E.coli BL21(DE3)进行表达，并且通过SDS-PAGE进行验证，通过免疫印记检测其反应源性，具体操作步骤同FABP的表达与鉴定；免疫金标渗滤法(DIGFA)的建立；DIGFA 与 ELISA 比较检测。进一步，脑多头蝴HSP基因的RT-PCR扩增，根据四川农业大学动物寄生虫学实验室测序完成的多头带绦虫转录组数据，利用Primer Primer 5.0软件设计一对引物，由大连宝生物工程有限本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法，其特征在于，该方法从羊脑多头蚴原头节提取总RNA，采用RT?PCR技术首次扩增出HSP基因序列，该基因的开放阅读框为408bp，编码136个氨基酸；将此基因克隆到pET?32a(+)载体，构建重组表达质粒pET?32a?HSP，经转化大肠杆菌BL21（DE3）后IPTG诱导表达，用SDS?PAGE和Western?blot检测表达产物；以纯化后的表达蛋白作为抗原，建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨光友，聂华明，彭雪蓉，古小彬，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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