CD44，即单链透明质酸(HA)结合糖蛋白，其表达在多种正常组织、全部造血细胞和若干癌症组织中。针对来自杂交瘤H460-16-2的CD44的单克隆抗体，以前显示为是减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)，在癌症模型包括前列腺癌和乳腺癌中通过细胞毒性抑制肿瘤生长和减小肿瘤负荷，所述杂交瘤H460-16-2以保藏号PTA-4621保藏在ATCC中。还分离和测序了该单克隆抗体的可变区，从而制备具有比该单克隆抗体提高的抗癌活性的嵌合抗体。现在制备与母体PTA-4621单克隆抗体具有相似CD44结合活性的人源化抗体。所述单克隆、嵌合和人源化抗体可以与毒素、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分和造血细胞缀合，从而治疗癌症。这些抗体还用在结合测定中以确定CD44在细胞上的表达。
Chimeric and humanized anti CD44 antibody mediated cytotoxicity of cancer cells
CD44, a single chain hyaluronic acid (HA) binding glycoprotein, is expressed in a variety of normal tissues, all hematopoietic cells and some cancer tissues. Monoclonal antibodies against H460-16-2 from hybridoma CD44, was previously shown to be cancerous disease modifying antibodies (CDMAB), the model of cancer including prostate and breast cancer by cytotoxicity in inhibiting tumor growth and reduce tumor load, the hybridoma H460-16-2 in ATCC with preserved PTA-4621 preservation. A variable region of the monoclonal antibody is also isolated and sequenced to prepare a chimeric antibody having an anti-cancer activity enhanced by the monoclonal antibody. Humanized antibodies with a similar CD44 binding activity to the monoclonal antibodies against PTA-4621. The monoclonal, chimeric and humanized antibodies can be conjugated with a toxin, an enzyme, a radioactive compound, a cytokine, an interferon, a target or a reporting portion and a hematopoietic cell to treat cancer. These antibodies were also used to determine the expression of CD44 on the cell.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及诊断和治疗癌性疾病,具体地,涉及介导肿瘤细胞细胞毒性；和更具体地，涉及减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)，任选与一种或多种CDMAB/化疗剂组合作为用于起始细胞毒性响应的工具的应用。本专利技术还涉及利用本专利技术CDMAB的结合测定。
技术介绍
癌症中的CD44:针对人白细胞生成单克隆抗体导致发现CD44抗原；一种在广泛多样的正常组织上和全部类型的造血细胞上表达的单链透明质酸(HA)结合糖蛋白。其最初与淋巴细胞活化和归巢有关。当前，其推定的生理学作用还包括活化炎性基因、调节细胞周期、诱导细胞增殖、诱导分化和发育、诱导细胞骨架重构和细胞迁移和细胞针对凋亡的存活/抗性。在人类中，⑶44的单基因拷贝位于染色体11的短臂，11ρ13上。该基因含有19个外显子；最开始的5个是恒定的，之后的9个是变化的，再之后的3个是恒定的且最后2个是变化的。分化剪接可以导致超过1000种不同的同种型。然而，目前仅确定了数打天然存在的变体。⑶44标准糖蛋白由N-末端胞外(包括20个a.a.引导序列，和膜近侧区(85a.a.))结构域(270a.a.)，跨膜区(21a.a.)和细胞质尾部(72a.a.)组成。胞外区还包含位于N-末端的连接构件。该区长度为92a.a.，并显示出与其他HA结合连接蛋白的同源性。在CD44的小鼠和人形式之间存在高度的同源性。该蛋白的变体形式插入到外显子5的羧基末端并在表达时位于细胞外。⑶44的血清可溶性形式也天然存在并可以由终止密码子(可变区内)或由蛋白水解活性产生。来自多种刺激包括TNF-α的细胞活化导致CD44受体的释放。对于肿瘤细胞也观察到该受体的释放，并且其可以导致人血请⑶44浓度增高高达10倍。高⑶44血清浓度提示恶性肿瘤(卵巢癌是例外)。⑶44的标准形式以约37kD的分子量存在。翻译后修饰使分子量增加到80_90kD。这些修饰包括位于天冬酰胺残基处的氨基末端胞外结构域N-连接的糖基化，位于胞外结构域的羧基末端的丝氨酸/苏氨酸处的O-连接的糖基化和粘多糖添加。剪接变体可以在80-250kD的尺寸范围内变化。HA，位于哺乳动物中的胞外基质(ECM)上的多糖，被认为是主要的⑶44配体。然而，还发现CD44结合这样的蛋白，如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等。HA结合和糖基化之间似乎存在相关性。失活的CD44 (不结合HA)具有最高水平的糖基化，活性CD44 (结合HA)具有最低的，而可诱导的CD44(不或 很弱地结合HA，除非受到细胞因子、单克隆抗体、生长因子等的活化)具有活性和失活形式之间某处的糖基化水平。⑶44可以通过信号转导途径介导它的一些功能，这取决于细胞、刺激和环境的相互作用。这些途径中的一些包括NF K B信号传导级联(参与炎性反应)、Ras-MAPK信号转导途径(涉及活性细胞周期和增殖)、蛋白质Rho家族(涉及细胞骨架重构和细胞迁移)和PI3-K-相关信号传导途径(涉及细胞存活)。全部上述功能与肿瘤疾病的开始和进展密切相关。⑶44还涉及在癌症中通过多种另外的机制起作用。这些包括通过⑶44细胞表面上存在的细胞表面蛋白聚糖对参与恶性肿瘤的受体呈递生长因子、趋化因子和细胞因子。而且，在⑶44-HA复合物内在化后由溶酶体透明质酸酶引起的HA胞内降解可以通过ECM潜在地增加肿瘤侵入和诱导血管发生的可能性。另外，显示出存活或凋亡信号的传输通过标准或可变⑶44受体发生。还提示⑶44参与细胞分化和迁移。这些机制中的许多，如果不是全部，是环境和细胞依赖性的，且若干引起可变的结果。因此，在可以得出任何结论之前需要更多的研究。为了验证⑶44在癌症中的潜在功能作用，采取⑶44的表达研究以确定该受体的分化表达是否与疾病进展相关。然而，在大部分肿瘤类型中观察到不一致的结果，且这可能归因于研究者之间的试剂、技术、病理学评分和细胞类型差异的组合。肾细胞癌和非霍奇金淋巴瘤似乎是另外，其中具有高CD44表达肿瘤的患者一致地具有比他们的低或非CD44表达的负体更短的存活时间。由于其与癌症的联系，⑶44已经是抗癌治疗发 展的靶标。仍然存在一些争论，如关于肿瘤进展需要CD44的标准形式还是变体形式。存在支持这两种观点的体内动物数据，并且同样地其可以是肿瘤类型和甚至细胞类型依赖性的。不同的治疗方法已经包括注射可溶性⑶44蛋白，乙酰透明质酸合成酶cDNA，透明质酸酶，使用⑶44反义和⑶44特异性抗体。每种方法引起了一定程度的成功，从而为抗CD44癌症治疗提供支持。已经实验室生成了变体和标准⑶44特异性单克隆抗体，但是在很大程度上，这些抗体不具有固有的生物活性，相反地，它们特异性结合它们识别的CD44类型。然而，这些是在体外或体内但通常不在两处具有活性的一些。若干抗CD44抗体显示出介导细胞事件。例如，鼠抗体A3D8，针对人红细胞卢氏抗原⑶44标准形式，显示出增强⑶2 (9-1)抗体和⑶3 (0KT3抗体)介导的T细胞活化；另一种抗⑶44抗体具有类似的作用。A3D8还诱导IL-1从单核细胞中释放和IL-2由T淋巴细胞中释放。有趣地，与药物诸如柔红霉素，米托蒽醌和依托泊苷联合使用A3D8通过消除第二信使神经酰胺的产生抑制HL60和NB4AML细胞中的凋亡诱导。J173抗体，其不具有固有活性且针对CD44的类似表位，不抑制药物诱导的凋亡。而且，A3D8和另一种抗⑶44单克隆抗体H90，以及乙酰透明质酸，诱导来自急性骨髓型白血病(AML)患者的白血病胚细胞的分化。然而，在相同的研究中，也结合CD44标准形式的J173抗体不诱导相同细胞的分化。有趣地，H90不结合来自其AML细胞与J173结合的患者子集的AML细胞，这说明这些抗体识别不同的表位。在一项独立的研究中，A3D8和H90均诱导若干AML-来源的细胞系的末期分化。NH44-1抗体，其针对⑶44的85_110kD和200kD形式，通过作者推测为交联或聚集CD44的途径，增加T细胞增殖。总之，不存在这样的证据，即抗体诸如这些适合于用作癌症治疗法，因为它们不针对癌症(例如，活性淋巴细胞)，诱导细胞增殖，或当与细胞毒性试剂一起使用时抑制药物诱导的癌细胞死亡。已经描述了若干抗⑶44抗体，这证明了体内抗肿瘤作用。抗体H90是通过用人红细胞(RBCs)免疫小鼠产生的鼠单克隆抗体，且其据报告结合CD44的所有同种型。对用辐射处理的已接种人AML细胞的NOD-SCID小鼠施用该抗体，三次/周，4周，通过这些细胞阻断种群恢复。另外，在由经历了使用H90抗体处理的动物中获得细胞时，来自这些动物的AML细胞的连续传代未能在接受者小鼠中种群恢复。该抗体的作用似乎是通过干扰白血病干细胞的分化和AML细胞与适当生态位之间的相互作用来介导的。另外，受辐射的具有人脐带血干细胞的NOD-SCID小鼠的种群恢复不受该处理的损伤，这说明了该抗体的选择性作用和还有AML和正常人造血干细胞之间的重要表现型差异。抗体1.1ASML,即针对⑶44的v6变体的小鼠IgGl，显示出减少大鼠胰腺腺癌BSp73ASML的淋巴结和肺转移。受处理的动物的存活随之增多。抗体只有在淋巴结建群之前施用时才有效，且假定其干扰淋巴结中的细胞增殖。体外不存在该抗体对肿瘤细胞直接细胞毒性，且该抗体不增强补体介导的细胞毒性，或免疫效应子本文档来自技高网...
【技术保护点】
特异性结合人CD44的人源化抗体，其中所述单克隆抗体包括SEQID?NO：7的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ?ID?NO：8的轻链可变区氨基酸序列；或其人CD44结合片段。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：戴维·S·F·杨，海伦·P·芬德利，苏珊·E·哈恩，莉萨·M·切凯托，福尔图娜塔·麦康基，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：
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