本发明专利技术提供了一种稳定性高的人源抗VEGF抗体及其应用。通过计算机辅助分子设计结合实验验证，对一株抗VEGF功能抗体的轻重链可变区进行热稳定性改造，在不降低抗体亲和力的前提下，获得了热稳定性更好的突变体抗体，将各突变位点进行叠加突变，获得的突变体抗体热稳定性较亲本抗体最高提高7℃以上。本发明专利技术获得的稳定性高的突变体抗体分子，有利于该抗体成药后的储存，同时为其他抗体的稳定性改造提供可供借鉴的经验。
Highly stable human anti VEGF antibody and application thereof
The present invention provides a high stability human anti VEGF antibody and its application. Through the computer aided molecular design and experimental verification of thermal stability, transformation of an anti VEGF functional antibody VH, on the premise of reducing the affinity of antibodies, antibody mutants obtained better thermal stability, the mutations were superimposed, mutant antibody thermal stability than the parent antibody increased more than 7 DEG C. The mutant antibody molecule with high stability obtained by the invention is favorable for the storage of the antibody after the patent medicine, and can provide the reference for the stability of other antibodies.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质工程领域，尤其是涉及治疗用人源抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体的体外热稳定性改造，具体地，涉及针对一株抗VEGF人源抗体，通过计算机分子模拟技术对抗体进行结构模建，并对影响抗体结构稳定性的氨基酸进行定点突变，通过实验对突变体进行亲和力和热稳定性的评价，筛选获得了热稳定性明显提高的突变体抗体。
技术介绍
与其他蛋白药物相比，抗体药物具有结构稳定、易于表达纯化、易于储存及体内半衰期长等特点，这也是其成为生物制药领域领军力量的重要原因之一。抗体的结构稳定性是影响其能否成为一个好的临床药物分子的重要因素之一，良好的结构稳定性是维持抗体与抗原特异性结合能力的基础。抗体结构稳定性研究不仅是生物物理学中蛋白质折叠理论的重要组成部分，也是治疗性抗体开发过程中必须面对的问题。结构稳定性不仅影响抗体的表达、纯化和储存，也影响其在体内与靶标抗原结合的亲和力和特异性，从而导致其体内生物学活性的丢失或毒副作用的增加。人们对抗体稳定性的关注伴随着治疗性抗体产业的整个发展过程。对影响抗体结构稳定性的因素以及引发其结构不稳定的机制也进行了较深入的研究。热失活是抗体结构的不稳定最常见的形式， 评价抗体抗热失活能力是评价其结构稳定性的重要指标。抗体的热稳定性从本质上是指,抗体的天然态(Native state)与其去折叠态(Unfolded state)之间的自由能之差，即折叠自由能。理论上,抗体热稳定性越高,其抗热失活能力越强，这对抗体的开发具体重要的意义。首先，抗体的热稳性越高，则其新生肽链在细胞内装配时产生错折叠(mis-folding)的概率越低，从而可溶性表达量也越高。因此，提高抗体的稳定性，可以大幅降低生产成本，从而使得药物便于普及。其次，近十年的研究还表明，抗体的热稳定性与其在体内对各种蛋白酶的耐受性是相关的。抗体热稳定性越高，则其结构折叠的越紧凑，进而其内部的蛋白酶切位点越不容易暴露在外，因此在体内越不容易被蛋白酶降解，从而使得其在相同体内清除速度下在体内的剩下有效成分越多，而这在客观上使得在给药剂量相同的情况下其血药浓度越高。更重要的是，抗体的稳定性是其行使正确生物学功能的保障，抗体稳定性越高，其在体内保持生物活性的时间也越长。由此可见，较高的热稳定性，是一株治疗性抗体能否最终走上临床并投放市场的关键因素之一。除此以外，抗体的热稳定性对于其保质期及存放条件等性质也是至关重要的。热稳定越高，则在相同条件下的保存时间也就越长，而且对保存环境的要求也相对较低一而这在一定程度上也降低了抗体的储存和物流成本。因此，在保证抗体亲和力、特异性及表达量等性质不受太大影响的情况下，最大程度上提高其热稳定性，对于抗体药物研发具有重要的现实意义与应用价值。目前，针对抗体稳定性改造的比较经典的几种方法包括:⑶R移植的方法，基于晶体结构的计算机辅助分子设计、基于抗体同源模建的计算机辅助分子设计、基于蛋白质折叠理论指导下的分子改造策略以及基于已有结构知识的分子改造策略等。在以往的研究中，针对抗体稳定性改造成功的报道很多，其所采用的方法也不尽相同。通过上述的一种或几种方法的应用，均有成功案例的报道。尽管这些技术方法还未形成成熟的技术体系，但这些研究却为更深入的了解抗体结构稳定性提供了大量的素材。由于抗体包括轻、重链两条链，因此其结构比较复杂，其整体结构的稳定性取决于:轻链和重链各自的稳定性、轻重链之间的界面稳定性及铰链区稳定性等几个方面，而轻重链的稳定性又细分为局部稳定性和整体稳定性。从影响蛋白结构稳定性的影响因素分析，影响局部稳定性因素包括局部结构熵、折叠和去折叠自由能、β转角位置及类型、特殊氨基酸如Pro和Gly所处位置是否合理、内部和表面氨基酸与其所处环境十分和谐及增加关键部位的氢键和其他有利于结构稳定的作用力等，而分子的整体稳定性除了取决于局部稳定性之外，还应考虑分子整体的去折叠次序和去折叠能量势垒等分子的热动力学特征。这些都是指导抗体稳定性改造的重要思路和技术方法。抗体分子是一类较特殊的蛋白分子，其结构除重链CDR3变化巨大外，其他5个CDR区及框架区的结构变化较小，大部分抗体在除HCDR3以外的部分具有较相似的标准化结构特征。抗体的这种结构特征，为将计算机辅助药物设计(Computer Aided Drug Design,CADD)用于抗体的分子改造提供了可能。目前，通过计算机辅助分子设计的方法提高抗体结构稳定性的成功案例很多。从本质上来讲，CADD是分子模拟(molecular modeling)方法在制药领域的综合应用。随着分子模拟理论的完善及技术的进步，分子模拟方法正越来越多地被用于蛋白质结构-功能关系、蛋白质与配体的相互识别以及药物设计的研究工作当中。现在，分子模拟方法在某些方面已经成为实验研究难以替代的手段。按照分子模拟方法的理论基础，可将其大致 分为三类，即基于牛顿力学，基于量子力学和基于知识的分子模拟方法。其中基于牛顿力学的分子模拟方法包括分子动力学模拟(molecular dynamicssimulation)、分子对接(molecular docking)和同源模建(homology modeling)等各种经典方法。其优点是理论基础扎实，计算速度较快，且在绝大多数情况下计算结果可靠，因此成为了当今分子模拟领域的主流方法。计算机辅助分子模拟为了解抗体及复合物的结构提供了良好的平台支持，近年来，通过计算机辅助分子模拟对抗体分子进行设计或改造，尤其是对抗体进行体外亲和力成熟的成功报道越来越多，证明该技术在抗体研制领域具有重要的作用，国际上甚至开始尝试通过计算机模拟筛选的方法获得所需要的目标抗体。然而，由于我国的抗体药物开发起步较晚，相关的技术方法体系还处于建立初期，少有利用计算机分子分子设计进行抗体分子优化的报道，尤其尚未发现将其用于抗体稳定性改造的报道。申请人一直从事原创性治疗性抗体的研发工作，通过自构建的大容量人抗体资源库技术获得了一些原创性候选抗体品种。在VEGF靶标抗原治疗性抗体的研究中，申请人获得了一株在体外具有和贝伐单抗中和活性相当的抗体分子，有望成为全新的抗VEGF候选药物。但其结构稳定性较差。因此需要获得稳定性明显改善的突变体抗体分子，为其进一步开发抗VEGF药物奠定基础，同时也希望完善对抗体分子物理结构稳定性的理论认识以及计算机辅助药物分子设计在该领域的不足和缺陷，为其他抗体药物的改造提供技术和理论支持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供热稳定性明显提高的抗VEGF抗体及其活性片段。 本专利技术的第二个目的在于提供抗VEGF抗体的应用。本专利技术运用计算机分子模拟技术对一株热稳定性和体外放置稳定性很差的抗VEGF功能抗体的可变区进行了全方面稳定性改造，通过亲和力和稳定性筛选，最终获得了多个亲和力基本不变，但对该抗体稳定性具有正向作用的轻、重链突变位点，并进一步证实这些突变位点可以进一步通过叠加突变，使抗体热稳定性进一步提高。最终其热稳定性较亲本抗体提高7°C以上。本专利技术提供的抗体，各种抗体形式均包含在内。如，抗VEGF抗体可以是全抗体或抗体片段。进而，抗体可以被标记检测标签，固定在固相或交联异源复合物(如细胞毒性物质)。抗体可以做诊断或治疗用。在诊断应用时，本专利技术提供一种检测V本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人源抗VEGF抗体，其特征在于，其轻链可变区的含有如SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列；或其轻链可变区含有如SEQ?ID?No.7所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王双，孙志伟，曾大地，常红艳，仇玮祎，孙九如，范志和，杨涛，范铁炯，
申请(专利权)人：上海赛伦生物技术有限公司，中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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