本发明专利技术涉及“对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因cry2Ah-like及应用”，属于生物技术领域。对鳞翅目害虫高毒力杀虫蛋白Cry2Ah-like，Cry2Ah-likesp，Cry2Ah-likevp，其蛋白序列分别如SEQ?ID?NO1、SEQ?ID?NO2、SEQ?ID?NO3所示。本发明专利技术提供的新的基因对棉铃虫、玉米螟具有高毒力，丰富了杀虫基因资源，同时将基应用于转化微生物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生。
Cry2Ah-like gene with high virulence to Lepidoptera pests and its application
The invention relates to a high virulence insecticidal gene cry2Ah-like and its application to Lepidoptera pests, belonging to the field of biotechnology. The insecticidal proteins Cry2Ah-like, Cry2Ah-likesp, Cry2Ah-likevp, which are highly toxic to lepidopteran pests, were found to be SEQ, ID? NO1, ID? NO2, SEQ? ID? NO3, respectively. The invention provides a new gene with high toxicity to cotton bollworm, corn borer, rich insecticidal gene resources, while the base for microbial transformation, which showed toxicity to relevant pests, and to overcome the resistance of pests, delaying engineering bacteria produce.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别是涉及苏云金芽孢杆菌对鳞翅目害虫高毒力的新的杀虫基因 cry2Ah_like, cry2Ah_likesp, cry2Ah_likevp 及其应用。
技术介绍
虫害是造成农作物减产的重要原因之一，减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物产量的重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14%，直接给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10%、小麦减产20%、棉花减产30%以上。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，生物杀虫剂成本较高。长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。因此，减少杀虫剂使用量，发展现代植物保护技术，已成为可持续发展农业中必须正视的课题之一。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins,ICPs)，也称 δ -内毒素(delta-endotoxin) ，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。 1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自BtcryIAcο在接下来的几年里，转cryIAb基因的抗虫玉米,转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有crylAc/crylA基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2009年有25个国家的1400万小农户和大农场主种植了 1.34亿公顷(3.3亿英亩)的转基因作物，比2008年增长了 7%，即900万公顷(2200万英亩)，达到历史最高点；相应的“性状或实际面积”增长了 8%，即相比2008年的1.66亿公顷，增长了 1400万公顷，达到2009年的1.8亿公顷。1996年至2009年间转基因作物种植面积空前地增长了 80倍，使转基因成为农业近代史上利用最快的作物技术。由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。
技术实现思路
本专利技术提供一种新的对玉米螟、棉铃虫等鳞翅目害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白基因序列，以应用于转化微生物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生。对鱗翅目害虫高毒力杀虫蛋白Cry2Ah_like, Cry2Ah_likesp, Cry2Ah_likevp,其蛋白序列分别如SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03所示。编码上述蛋白的杀虫基因，名称为cry2Ah_like, cry2Ah_likesp, cry2Ah_likevp,其基因序列分别如SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06所示。含有上述基因的载体。所述载体分别为pET2Ah-like、pET2Ah_likesp 和 pET2Ah_likevp，其骨架载体为pET。 所述基因在杀灭棉铃虫、玉米螟中的应用。所述应用为将基因表达的蛋白制成药剂杀灭棉铃虫、玉米螟。所述应用为将基因转化微生物或植物，使植物受体表达对棉铃虫、玉米螟的抗性。本专利技术从SC6H8菌株(新型cry2基因克隆、表达及活性分析，张静涛，2009，硕士论文)中克隆得到了一个新的基因即cry2Ah-like，该基因序列如SEQ ID N04，蛋白序列如SEQ ID N01，该基因对棉铃虫、玉米螟具有高毒力。利用重复PCR得到了 cry2Ah-like的两个突变体，该两个突变基因的序列分别为SEQ ID N05, SEQ ID N06 ;蛋白序列如SEQ ID N02, SEQ ID N03，该两个突变体基因对棉铃虫的毒力较cry2Ah_like高。本专利技术提供的新的基因对棉铃虫、玉米螟具有高毒力，丰富了杀虫基因资源，同时将基应用于转化微生物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生。附图说明图1 cry2Ah_like基因在大肠杆菌BL21菌株中表达，图2 cry2Ah_likesp和cry2Ah_likevp基因在大肠杆菌BL21菌株中表达，图3杀虫活性趋势图，图4pET2类基因的载体结构图。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。Bt质粒提取RNaseA (10mg/ml):称取 0.1g RNaseA 溶于 IOmllOmM Tris HCl (pH7.5)，15mMNaCl中，100°C煮沸15min，冰浴冷却，_20°C保存备用。SC6H8菌株，申请人的实验室有保存，可以对外公开发放。1.过夜培养5ml SC6H8菌液。2.离心收集菌体，用含有30mg/ml溶菌酶的25%的蔗糖溶液悬浮细胞，总体积为200 μ 1，37。。孵育 15mins。3.加入400 μ I碱裂解液(3%SDS，0.2N NaOH)，立即缓慢混勻，室温孵育5mins。4.加入300 μ I冰冷的3Μ醋酸钠(ρΗ4.8)，立即混匀，12000g离心IOmins05.取上清，加入等体 积的异丙醇，充分混匀，_20°C放置30mins，12000g离心5mins。6.弃上清，70%乙醇洗涤沉淀，晾干后加入320ul纯水溶解沉淀，加入200 μ I含有0.5mg/ml EB的7.5M醋酸铵溶液。混勻后加入等体积的酹氯仿,混勻。12000g离心5mins。7.取上清，加入2倍体积冰冷的无水乙醇，充分混匀，_20°C放置30mins，12000g离心 5mins。8.去上清，70%乙醇洗涤沉淀，晾干，加入40 μ I TE溶解沉淀，加入I μ I RNase A除 RNA。0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。DNA回收(步骤参见Axygen公司试剂盒)1.在长波紫外灯下切下含所需目的DNA片段的凝胶，置于1.5mL离心管中；2.加入3倍溶胶体积的ED-A溶胶缓冲液，置于70° c水浴锅中；3.待溶解后加入0.5个ED-A溶胶缓冲液的ED-B ；4.混勻后转入回收柱，离心12000r/min0.5min ；5.弃去残液,加入洗脱缓冲液W1SOO μ L,离in心12000r/min0.5min ；6.弃去残液，加入洗脱缓冲液W2700 y L，重复一次；本文档来自技高网...
【技术保护点】
对鳞翅目害虫高毒力杀虫蛋白Cry2Ah?like，Cry2Ah?likesp，Cry2Ah?likevp，其蛋白序列分别如SEQ?ID?NO1、SEQ?ID?NO2、SEQ?ID?NO3所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：束长龙，张杰，耿丽丽，宋福平，彭琦，黄大昉，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。