本发明专利技术公开了一种烷基化衍生试剂及其在肽段标记、质谱检测中的应用。所述烷基化衍生试剂为：溴化1-[3-[(2-碘-1-氧乙基)氨基]丙基]-3-丁基咪唑（IPBI），其结构如式（Ⅰ）所示。本发明专利技术所提供的烷基化衍生试剂以碘乙酰胺基为活性功能团，同时具有强疏水性、强气相碱性且具有包含永久性正电荷的结构特征，可实现多肽/蛋白质中活性巯基的选择性衍生和高效标记，可显著地提高质谱分析中肽段的带电荷数、离子化效率和检测灵敏度，从而显著提高含半胱氨酸肽段的检出率。同时，本发明专利技术所提供的烷基化衍生试剂合成过程简单、成本较低、反应重现性好，宜于推广应用。
Alkylated derivative reagent and its application in peptide labeling and mass spectrometric detection
The invention discloses an alkylated derivative reagent and its application in peptide labeling and mass spectrometric detection. The alkylating reagent is 1-[3-[(2-) (-1-)]-3- (IPBI) (). The present invention provides alkylation reagent with iodoacetamide based active functional groups, but also has strong hydrophobicity, strong gas phase basicity and has structural features including a permanent positive charge and can realize selective peptide / protein thiol derivative active and efficient marker, which can remarkably improve the mass spectrometric analysis of peptides with charge number, ionization efficiency and detection sensitivity, which can significantly improve the detection rate of cysteine containing peptides. At the same time, the method provided by the invention has the advantages of simple synthesis process, low cost and good reaction reproducibility, and is suitable for popularization and application.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物大分子的标记，具体地说是一种烷基化衍生试剂及其在肽段标记、质谱检测中的应用。
技术介绍
在后基因组学时代，蛋白质组分析受到越来越广泛的关注。然而，蛋白质样品组成的极端复杂性、宽动态范围分布特别是翻译后修饰的存在，使得其分析仍旧面临着巨大的挑战。以鸟枪法(Shotgun)为代表的bottom-up策略是复杂蛋白质组样品分离鉴定最常采用的策略，这一策略首先将蛋白质样品经蛋白质酶酶切，产生的多肽混合物经色谱分离后再通过质谱进行多肽鉴定。可见，质谱技术是蛋白质组研究必不可少的工具。然而，基于质谱技术的多肽分析策略其主要缺陷在于不同的肽段其离子化程度具有显著的差异，此外，肽段还存在不充分离子化的问题，其主要原因在于不同的肽段具有不同的二级结构、分子量大小，带电荷状态以及亲疏水性的差异，使得不同肽段的质谱检测灵敏度具有显著的差异。特别是对于复杂蛋白质样品的分析，其宽动态范围分布使得低丰度肽段，特别是一些药物靶点蛋白质或生物标记物的酶切肽段受到高丰度肽段的抑制，其质谱检测仍旧存在较大的困难。因此，改进肽段，特别是低丰度肽段的质谱检测灵敏度具有重要意义。为了提高肽段特别是低丰度肽段的质谱离子化效率，近年来，通过化学衍生技术在多肽中引入易于离子化标签的方法获得了广泛关注。Williams等合成了一系列疏水性的烧基化标签(如:2_碘-N-辛烧基乙酰胺和2-碘-N-节基乙酰胺)以改善半胱氨酸肽段的质谱离子化效率(Williams D.K., Meadows C.ff., Bori 1.D., Hawkridge A.Μ., CominsD.L.，Muddiman D.C .，J.Am.Chem.Soc.2008, 130:2122-2123)，B 型利钠肽经 2-碘-N-辛烧基乙酰胺衍生后，其质谱检测限可降低约3.5倍(Shuford C.M., Comins D.L., WhittenJ.L., Burnett J.C., Muddiman D.C.，Analyst, 2010，135:36-41 )。Zabet-Moghaddam 等将疏水性标签，碘乙酰苯胺，用于含半胱氨酸肽段的烷基化衍生，与碘乙酰胺(IAA)修饰相t匕，模式肽段经碘乙酰苯胺衍生后其峰强度可提高4.6-6倍(Zabet-Moghaddam M., ShaikhA.L., Niwayama S., J.Mass Spectrom.2012，47，1546-1553)。Vasicek 等将季铵化标签，(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化胺，用于增强含半胱氨酸肽段在电子转移裂解(ETD)质谱中的分析鉴定能力，牛血清白蛋白酶切产物经衍生后其SEQUEST得分值可提高6倍，实现了高可信度的蛋白质鉴定(Vasicek L.，Brodbelt J.S.，Anal.Chem.2009，81，7876-7884)。尽管目前已有多种烷基化衍生试剂报道并应用于了半胱氨酸肽段的烷基化衍生，然而，多肽的质谱检测灵敏度改善比较有限，目前仅限应用于合成肽段或标准蛋白质酶解产物的分析。因此，发展新型高效的烷基化衍生化试剂对于深入的蛋白质组研究具有重要的意义
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够增强含半胱氨酸肽段质谱分析的烷基化衍生试齐U，以实现多肽/蛋白质中巯基的选择性衍生、高效标记，显著地提高衍生肽段的质谱带电荷数、离子化效率和检测灵敏度，显著提高含半胱氨酸肽段的质谱检测能力。本专利技术进一步的目的是提供所述烷基化衍生试剂在肽段标记、质谱检测中的应用。本专利技术所提供的烷基化衍生试剂1-丙基]-3-丁基咪唑(IPBI)，如式(I )所示结构，权利要求1.一种如式(1)所示的烷基化衍生试剂，2.权利要求1所述的烷基化衍生试剂的制备方法，其特征在于，以芳香季铵化咪唑为母体结构，通过缩合反应引入和肽段反应的活性碘乙酰胺功能基团。3.根据权利要求2所述的烷基化衍生试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: ①以1-丁基咪唑和3-溴丙胺氢溴酸盐为原料，于80 90°C回流反应16-24小时即得中间产物溴化1-(3-氨丙基)-3- 丁基咪唑； ②以乙腈水为溶剂，制备溴化1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑溶液，加入碘乙酸，在0-10°C条件下加入缩合剂进行缩合反应1-1.5小时，即得所述烷基化衍生试剂。4.根据权利要求3所述的烷基化衍生试剂的 制备方法，其特征在于，所述缩合剂为N，N’-羰基二咪唑、1-羟基-苯并-三氮唑或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。5.权利要求1所述的烷基化衍生试剂在肽段的标记及质谱检测中的应用。6.根据权利要求5所述的烷基化衍生试剂在肽段的标记及质谱检测中的应用，其特征在于，所述烷基化衍生试剂与肽段/蛋白质中的半胱氨酸发生标记反应。7.根据权利要求5所述的烷基化衍生试剂在肽段的标记及质谱检测中的应用，其特征在于，肽段衍生方法包括以下步骤: ①将浓度为0.1-0.4mg/mL的肽段用pH介于8.0-8.5的缓冲液溶解，然后加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，于50°C反应I小时，冷却至室温； ②向上述溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μ L，继续于37°C反应2小时即可。全文摘要本专利技术公开了一种烷基化衍生试剂及其在肽段标记、质谱检测中的应用。所述烷基化衍生试剂为溴化1-丙基]-3-丁基咪唑(IPBI)，其结构如式(Ⅰ)所示。本专利技术所提供的烷基化衍生试剂以碘乙酰胺基为活性功能团，同时具有强疏水性、强气相碱性且具有包含永久性正电荷的结构特征，可实现多肽/蛋白质中活性巯基的选择性衍生和高效标记，可显著地提高质谱分析中肽段的带电荷数、离子化效率和检测灵敏度，从而显著提高含半胱氨酸肽段的检出率。同时，本专利技术所提供的烷基化衍生试剂合成过程简单、成本较低、反应重现性好，宜于推广应用。文档编号C07D233/61GK103204812SQ20131014407公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日专利技术者乔晓强, 王蕊, 佘丹丹, 王涛 申请人:河北大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种如式（Ⅰ）所示的烷基化衍生试剂，FDA00003092171600011.jpg
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：乔晓强，王蕊，佘丹丹，王涛，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：
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