本发明专利技术提供一种样品分析方法。在某些实施方案中，所述方法包括：a）从样品扩增产物以产生扩增的样品，所述样品包含基因组座位的野生型拷贝和所述基因组座位的突变体拷贝，所述突变体拷贝相对于所述基因组座位的所述野生型拷贝具有点突变，其中：i.扩增使用第一引物和第二引物完成；以及ii.第一引物包含与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸，还包含与所述基因组座位中除了在所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；和b）使用活瓣分析检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用侵入寡核苷酸。本发明专利技术还提供进行所述方法的试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】突变检测分析相关申请的交叉引用本申请要求2010年11月15日递交的美国专利申请系列号12/946,752的申请日的优先权，该申请公开的内容通过引用的方式并入本文。背景人类基因组中的一些点突变与疾病有直接关联。例如，发现一些生殖系KRAS突变与努南综合征(Schubbert等人Nat.Genet.200638:331 - 6)和心-面-皮肤综合征(Niihori等人.Nat.Genet.200638:294 - 6)相关联。同样，发现体细胞的KRAS突变在白血病、结直肠癌(Burmer 等人.Proc.Natl.Acad.Sc1.198986:2403 - 7)、膜腺癌(Almoguera 等人.Celll98853:549 - 54)和肺癌(Tam 等人.Clin.Cancer Res.200612:1647 - 53)中高频出现。人类基因组中有许多点突变与疾病没有明显的致病关联。点突变的检测方法可用于，例如，提供与点突变相关联的疾病的诊断。概述本专利技术提供样品分析的方法。在某些实施方案中，所述方法包括:a)从样品扩增产物以产生扩增的样品 ，所述样品包含基因组座位的野生型拷贝和所述基因组座位的突变体拷贝，所述突变体拷贝相对于所述基因组座位的所述野生型拷贝具有点突变，其中:1.扩增使用第一引物和第二引物完成；以及i1.第一引物包含与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸，还包含与所述基因组座位中除了在所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；和b)使用活瓣分析(flap assay)检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用侵入寡核苷酸。本专利技术还提供进行所述方法的试剂盒。附图说明图1示例性说明了活瓣分析的一些一般原则。图2示例性说明了所述方法的一个实施方案。图3-7各提供更详细描述于本申请实施例部分的数据。定义本文使用的术语“样品”涉及材料或材料的混合物，通常情况下，尽管这不是必须的，以液体形式，含有一种或多种感兴趣的分析物。术语“核苷酸”旨在包括那些不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基而且包含已被修饰的其他杂环碱基的基团(moieties)。这些修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，烷基化的核糖或其他杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些包含半抗原或荧光标记并可以不仅包含常规核糖和脱氧核糖的糖，而且也可以包含其他糖的基团。修饰的核苷或核苷酸也包括对所述糖基团的修饰，例如，一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，官能化为醚、胺等。术语“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可以互换使用，用于描述任意长度的聚合物，例如，长于大约2个碱基，长于大约10个碱基，长于大约100个碱基，长于大约500个碱基，长于大约1000个碱基，长达大约10，000个或更多碱基组成的核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并可通过酶法或合成法制备(例如，PNA记载于美国专利号5，948，902和其中所引用的参考文献)其可以与天然存在的核酸以序列特异性的方式进行杂交，该方式与两种天然存在的核酸杂交类似，例如，能够参与沃森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶(分别为G、C、A和T)。本文使用的术语“核酸样品”指含有核酸的样品。本文使用的术语“靶多核苷酸”指研究中的目的多核苷酸。在某些实施方案中，靶多核苷酸含有研究中的一个或多个目的靶位点。本文使用的术语“寡核苷酸”指大约2至200个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以通过合成或可以通过酶法制备，并且，在一些实施方案中，长度为10至50个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体(即，可以为寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以为10至20、11至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150或150至200个核苷酸。本文使用的术语“双链体”或“双链的”描述两个互补的碱基配对的多核苷酸，SP，杂交在一起。本文使用的术语“引物”指这样的寡核苷酸，其具有与靶多核苷酸的一个区域互补的核苷酸序列。在引物延伸条件下，使用靶核酸作为模板，引物结合至所述互补区域并延伸。引物可为大约15至大约50个核苷酸范围内，但也可使用在上述长度范围之外的引物。引物可通过聚合酶的作用从引物的3’末端开始延伸。不能通过聚合酶的作用从其3’末端开始延伸的寡核苷酸不是弓I物。本文使用的术语“延伸”指向核酸末端添加一个或更多的核苷酸，例如通过寡核苷酸的连接或通过使用聚合酶。本文使用的术语“扩增”指使用靶核酸作为模板产生一个或更多拷贝的靶核酸。本文使用的术语“变性”指核酸双链体分开为两条单链。本文的术语“测定(determining)”、“测量(measuring)”、“评估(evaluating)”、“评估(assessing)”、“分析(assaying)”、“检测(detecting)”、“分析(analyzing)”可以互换使用，指任何形式的测量，并包括测定一种成分(element)存在与否。这些属于包括定性和/或定量测定。评估可为相对或绝对。“评估其存在”包括测定存在的某种物质的量，以及测定其存在或不存在。术语“使用”有其常规含义，因此，是指采用，例如，将方法或组合物付诸运行至结束。本文使用的术语“Tm”指寡核苷酸双链体的解链温度，在该温度，一半的双链体保持杂交而一半的双链体解离成单链。寡核苷酸双链体的Tm可以通过实验测定或使用下述公式预测:Tm=81.5+16.6 (1g10 )+0.41 (部分 G+C) - (60/N)，其中 N 是链长且小于 1M。参见 Sambrook 和 Russell (2001 ;Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rded., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y.’ch.lO)。还有其他预测寡核苷酸双链体的Tm的公式并且一个公式可以或多或少地适用于给定的条件或一组条件。本文使用的术语匹配的”指多个核酸双链体有在定义范围内的Tni,例如，在互相的5°C或10°C范围内。本文使用的术语“反应混合物”指试剂的混合物，所述试剂能够在能够在适当的外部条件下经过一段时间一起反应产生产物。反应混合物可以包含PCR试剂和活瓣切割试剂，例如，各自在本领域已知的配方。本文使用的术语“混合物”指成分的组合，所述成分是散在的并没有任何特定顺序。混合物是异质的且没有在空间上分离成其不同成分。混合物成分的实施例包括大量不同的溶解于相同水溶液的成分，或大量不同的附着到固相载体的成分或在没有特定顺序上不同成分在空间上没有不同。混合物是无法定位的(addressable)。举例说明，作为本领域中通常已知的，空间上分离的表面结合多核苷酸的阵列不是表面结合多核苷酸的混合物，因为此类表面结合多核苷酸空间上不同且所述阵列是可以定位的。本文使用的术语“PCR试剂”指对模板进行聚合酶链式反应(PCR)所必需的所有试齐U。正如本领域中已知的，PCR试剂基本上包括第一引物、第二引物、热稳定聚合酶和核苷酸。取决于所使用的聚合酶，也可存在离子(例如，Mg2+)。PCR试剂可本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹鸿志，G·P·李德加德，M·J·多马尼科，H·阿拉维，
申请(专利权)人：精密科学公司，
类型：
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。