RNA分子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种设计短RNA分子的方法，所述短RNA分子通过下调非编码RNA转录本而增加细胞中靶基因的表达，所述方法包括步骤：a）获得所述靶基因的编码链的核苷酸序列，该序列至少在所述基因的转录起始位点的上游200个核苷酸和所述基因的转录起始位点的下游200个核苷酸之间；b）确定与步骤a）中确定的核苷酸序列反向互补的RNA序列；和c）设计短RNA分子，所述短RNA分子与步骤b）中确定的序列的某一区域反向互补或与步骤b）中确定的序列的某一区域的反向互补序列有至少80%的序列一致性；其中，所述方法不包括确定非编码RNA转录本的存在的步骤；本发明专利技术还涉及这样的短RNA分子及其的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能够调节靶基因表达的短RNA分子及其设计、合成和应用。
技术介绍
RNA干扰(RNAi)是一种重要的基因调节机制，它能够引起靶mRNA的序列特异下调。RNAi通过“干扰RNA (iRNA)”介导；干扰RNA是概括性术语，包括多种在RNAi过程中起作用的短双链RNA (dsRNA)分子。外源dsRNA能够被核糖核酸酶蛋白Dicer加工成19至25个碱基对的双链片段，所述片段的每一个3’末端均有几个未结合的碱基，形成3’突出。这些短双链片段被定义为小干扰RNA (siRNA)，这些分子导致靶基因下调表达。基于它们功能的阐·明，siRNA已经被用作下调特定基因的工具。它们可以提供瞬时抑制；或者当它们稳定地结合成短发夹环RNA (shRNA)时，它们可以提供稳定抑制。siRNA和shRNA已经被广泛地应用于“敲减”或“功能丧失”实验，在这些实验中，通过观察目标基因表达的减少效果研究该基因的功能。RNAi被认为是具有作为绘制和注释基因组的技术的潜在益处。同样已经尝试开发在治疗中应用RNA干扰。一种被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的蛋白复合体与siRNA链之一结合并使用这条链作为识别靶mRNA的向导。依赖于向导RNA和mRNA之间的互补性，RISC破坏或抑制该mRNA的翻译。元全互补导致mRNA断裂和破坏，并且作为断裂的结果，mRNA不g纟再被翻译成蛋白。部分互补(特别是mRNA的3’未翻译区(UTR)中的位点)导致翻译抑制。RNAi在多数真核生物中是保守的，并且通过引入外源siRNA，RNAi可以被用作下调特定基因的工具。最近已经发现，尽管RISC主要调节基因的转录后，但是RNAi也可以调节基因转录本身。在裂殖酵母中，小RNA通过RISC复合体的类似物调节染色质。所述载有RNA的RISC复合体明显地结合非编码RNA(ncRNA)并因此将组氨酸修饰蛋白补充至ncRNA位置。植物、苍蝇、线虫、纤毛虫和真菌也具有类似的机制。在哺乳动物中，精确的机制仍然不清楚，但是人们相信，短RNA通过祀定以破坏转录本而调节转录,所述转录本是被调节的RNA的正义或反义链并且被推测为是非编码转录本。基于RNA靶的性质，通过RNA靶定破坏这些非编码转录本对表观遗传调节模式具有不同作用。破坏对于给定的mRNA是正义链的ncRNA靶导致该mRNA的转录抑制，而破坏对于给定的mRNA是反义链的ncRNA祀导致所述mRNA的转录激活。通过靶定这样的反义转录本，RNAi因此可以被用于上调特定基因。导致靶基因上调的短RNA分子被定义为短活化RNA分子(saRNA)。通过使用saRNA上调靶基因的已知方法包括:测定与目标靶基因反义的RNA转录本，设计下调所述鉴定的转录本的短RNA分子。从已知转录本或EST的数据库鉴定靶反义RNA转录本，所述已知转录本或EST位于目标基因的基因座周围的基因组区域中。可选地，反转录酶PCR (RT-PCR)(一种用于鉴定RNA的公知手段)被用于鉴定可能的靶RNA转录本。例如，US2009/0092988公开了一种选择性调节哺乳动物细胞的基因组中靶基因的表达的方法，包括:检测编码的反义转录本的存在并用外源双链RNA接触所述转录本，所述外源双链RNA与所述转录本的一部分互补。该专利技术人已经提供了一种设计上调靶基因的短活化RNA分子的新的算法/方法。该设计方法发现了在包括涉及多潜能性基因的基因组中的广泛适用性。Kruppel样因子4 (消化道)(KLF4)是一种重要的维持胚胎干(ES)细胞的转录因子。KLF4和三种其它转录因子P0U5F1 (也被称为0CT3/4)、S0X2和MYC的异位表达已经显示出将小鼠和人的成纤维细胞改编成诱导性多潜能干(iPS)细胞。一项近期的关于ES细胞转录网络的研究表明，KLF4是控制其它多潜能因子(包括P0U5F1、S0X2、MYC和NAN0G)的表达的主要调节因子。诱导性多潜能干细胞(iPSC)的发展已经成为理解干细胞领域的里程碑。iPSC技术依赖于四种基因KLF4、P0U5F1 (0ct3/4)、S0X2和MYC的上调，或者在某些细胞中，依赖于这四种基因中的几个和其它多潜能因子如NANOG和LIN28的上调。这通过将这些基因遗传引入至非胚胎干细胞而实现。已经怀疑操纵KLF4表达因此可以是控制干细胞的一种有效方法。可以通过上面提及的基因的激活将非胚胎细胞(如成纤维细胞)诱导成多潜能干细胞状态。从治疗观点，iPSC的主要优势是病患自己的成纤维细胞可以被改编以产生干细胞，这排除了对于免疫抑制药物或匹配组织相容性基因的需要。目前上调多潜能因子的表达的方法需要引入额外拷贝的所述基因(在该领域中被认为是干性(sternness)基因)，该引入过程可以通过使用病毒以将额外拷贝的基因引入至宿主基因组中或者通过引入表达额外拷贝的干性基因的质粒。因此，对于KLF4和其它干性因子的上调，普遍地需要将表达载体侵入性地瞬时转染或稳定地病毒转导至细胞。目前的方法包括上调制剂的非瞬时应用。这些方法的一个限制是它们的效果是相似地非瞬时的，即，被诱导的干细胞不能扩增并被改编以分化。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人已经开发了新的短RNA分子，这些短RNA分子能够实现上调或下调靶基因并克服与上述现有方法相关的问题。特别地，本专利技术的分子具有较少的侵入性并且它们的作用是瞬时的。因此，本专利技术的专利技术人已经提供了新的短RNA分子，所述短RNA分子靶定宿主细胞中的RNA转录本以调节靶基因，特别是作为诱导多潜能基因的靶基因或引起分化的基因。本专利技术的短RNA是比现有技术的表达载体小的分子，因此具有较少的侵入性；但是，本专利技术的分子使用宿主自身的调节系统以调节基因的事实同样比向宿主中引入额外拷贝的基因具有较少的侵入性。本专利技术的短RNA可以上调靶基因的mRNA和蛋白水平。本专利技术的算法设计方法导致设计上调靶基因表达的短活化RNA分子(saRNA)。本文所证明的是完全不同的选择的基因的上调，这些基因通过使用本专利技术的方法设计的saRNA分子上调，这些基因包括KLF4、MYC、P0U5F1、S0X2、BCL2 和 IL-8。 本专利技术的KLF4-、MYC-, P0U5F1-和S0X2-活化RNA对于扩增在再生医学中使用的造血干细胞是有效的、非入侵性的和安全的选择。本专利技术的一个主要优势是它涉及活化基因的小RNA的瞬时应用，这些小RNA的作用是瞬时的。这允许所述诱导的干细胞被扩增并随后被改编以分化。在第一个方面，本专利技术提供一种设计短RNA分子的方法，所述短RNA分子通过下调非编码RNA转录本而增加细胞中靶基因的表达，所述方法包括以下步骤:a)获得所述靶基因的编码链的核苷酸序列，该序列至少在所述基因的转录起始位点的上游200个核苷酸和所述基因的转录起始位点的下游200个核苷酸之间；b)确定与在步骤a)中确定的核苷酸序列反向互补的RNA序列；和c)设计短RNA分子，所述短RNA分子与步骤b)中确定的序列的某一区域反向互补或与步骤b)中确定的序列的某一区域的反向互补序列有至少80%的序列一致性；其中，所述方法不包括确定所述非编码RNA转录本的存在的步骤。另一方面考虑，本专利技术提供一种设计短RNA分子的方法，所述短RNA分子通过下调非编码RNA转录本而本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·赛特罗姆，
申请(专利权)人：米纳治疗有限公司，
类型：
国别省市：