利用量子点检测转基因水稻中Bt蛋白的方法技术

本发明专利技术属于转基因成分的检测技术领域，具体涉及一种利用量子点检测转基因水稻中转Bt蛋白的快速简便检测方法。该方法包括：以抗CrylAb单克隆抗体为一抗，量子点(QDs)标记羊抗兔IgG为二抗，制备得到CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心，建立了检测水稻Bt蛋白的双抗夹心荧光免疫吸附测定法，该方法对CrylAb标准蛋白的浓度最低可检值为9pg/mL，线性检测范围为6～200pg/mL，回收率在91.6～105.9，变异系数在3.0～12.6。本发明专利技术的量子点双抗夹心荧光免疫吸附测定法适合转基因水稻的定量检测，其特点是快速、简单和高灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于作物转基因成分的检测
，具体涉及，本专利技术与ELISA方法相关。
技术介绍
转基因生物的安全评价是转基因生物及其产品市场化和商品化的前提，在安全评价中转基因成分的检测是一项重要内容，建立转基因生物快速、简便、准确的检测方法为安全评价和管理奠定基础。我国对转基因水稻的研究处于世界领先水平，其中，研发的一些抗病、抗虫转基因水稻品系已经申请生产种植用生物安全证书，但由于它们的转基因生物安全问题等一些原因，至今尚未有品系批准商业化生产应用。鉴于转基因水稻技术的成熟以及其产品市场化的趋势，因此建立一种快速、简便的检测Bt蛋白的方法，具有必要性和紧迫性。目前对于转基因成分的检测可从外源基因的核酸和蛋白质两个水平进行。核酸水平的检测，主要针对转入的外源基因的核苷酸序列并根据外源基因与内源基因的同源性设计检测方法，主要采用的方法是PCR扩增，即依据转入外源基因的启动子、目的基因、终止子及表达(重组)载体信息，设计特异性引物，进行聚合酶链式反应，依据产物的有无或多少判断是否为转基因产品。PCR反应具有高灵敏度、高特异性、高效性的特点，是转基因产品初筛阶段的主要检测方法。蛋白检水平的检测，主要是基于抗原和抗体相互作用的免疫学方法，针对转基因植物及其产品中外源目的基因表达的特异性蛋白进行定性和定量检测。1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚丙乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosrbent Assay,简称 ELISA 方法)。1974 年 Voller 等人改用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附载体，使ELISA方法得以推广应用，使得用于抗原定位的酶标记抗体技术发展成为液体标本中微量物质的测定方法，并逐渐成为抗原抗体检测中最为常用的一种方法。它将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析方法，即在反应的每一步都有洗涤过程，从而除去了未反应物和干扰物质。由于ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测迅速和非放射性以及可以批量测定等诸多优点，使得ELISA方法得到了越来越广泛的应用。但是随着检测灵敏度的要求越来越高，具有独特荧光特性的量子点越来越受到人们的关注。量子点(quantumdots)是一种由II族 VI族或III族 V族元素组成的、稳定的、溶于水的、介于Inm IOOnm的、能够接受激发光产生突光的半导体纳米晶粒。当它的物理尺寸小于激子的玻尔半径时，由于量子限制效应，使其具有独特的光学和电子学性质。它的光学性质主要取决于它的半径的大小，而与它的组成无关，通过改变量子点的大小就可以获得从紫外到近红外范围内任意点的光谱。由于具有独特的荧光特性，量子点与传统的有机荧光染料相比具有以下优点:(I)具有宽的激发波长范围和窄的发射波长范围，即可以使用小于其发射波长IOnm的任意波长的激发光进行激发，这样就可以使用同一种激发光同时激发多种量子点，发射出不同波长的荧光，因而可用于多种标记物的同时检测。(2)量子点的发射峰窄而对称，且连续分布，重叠小，这样，在一个可检测到的光谱范围内可同时使用多个探针，而发射光谱不出现交叠，使生物分子的多组分分析检测变得容易。而传统的有机荧光染料的发射峰不仅宽，而且不对称，拖尾严重，互相重叠严重，容易互相干扰，给分析检测带来难以解决的难题。(3)量子点的发射波长可通过控制它的大小和组成来调谐，可以任意合成所需波长的量子点，大小均匀的量子点谱峰为对称高斯分布，而传统的有机荧光染料的峰形则为对数正态分布。(4)量子点的荧光强度比最常用的有机荧光染料罗丹明6G染料高20倍，它的稳定性更是罗丹明6G染料的100倍以上，而且量子点抗光漂白能力强。(5)生物相容性好，尤其是经过各种化学修饰之后，可以进行特异性连接，细胞毒性低，对生物体危害小，可进行生物活体标记和检测，而传统的有机荧光染料一般毒性较大，生物相容性差。(6)荧光寿命长，典型的有机荧光染料的荧光寿命仅为几纳秒(ns)，这与很多生物样本的自发荧光衰减的时间相当。而量子点的荧光寿命可持续长达数十纳秒(20ns 50ns)，这使得当光激发数纳秒以后，大多数的自发荧光背景已经衰减，而量子点荧光仍然存在，此时即可获得无背景干扰的荧光信号。这些独特的光学特性，使量子点成为了一种理想的荧光探针。因此，使用量子点代替有机荧光染料，将在分子标记、信号传导、细胞内分子的运动和迁移等研究中发挥重要的作用。利用量子点标记抗体已经成功的用于对鸡肉中的磺胺二甲嘧啶残留进行了荧光免疫检测。因此，利用量子点作为生物荧光探针，在免疫生物学和食品检测等研究中有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于转基因水稻中Bt的高灵敏度快速检测方法。本专利技术的方法基于量子点双抗夹心荧光免疫吸附测定法原理，建立定量检测转基因水稻中Bt蛋白含量的检测方法，本专利技术能准确快速、简单、高灵敏度检测出转基因水稻中Bt蛋白含量，不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本专利技术的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理提供借鉴。本专利技术的技术方案如下:一种利用量子点检测转基因水稻中Bt蛋白的快速简便方法，其步骤如下:(I)抗CrylAb单克隆抗体的制备以CrylAb蛋白为抗原获得兔血清,通过纯化得到抗CrylAb单克隆抗体作为一抗，分泌该单克隆抗体的抗CrylAb单克隆抗体杂交瘤细胞 HHX-001保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CTCC NO:C201214。(2) CdSe/ZnS量子点标记的羊抗免IgG抗体即二抗的制备I)将500 μ L羊抗免IgG抗体溶液分装成10等份的50 μ L小管子，保存于_20°C冰箱内，待用时取出一小管，置于4°C冰箱处,备用；2)取25 μ L CdSe/ZnS量子点母液，20 μ L 1-乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)端二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和10 μ LN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，ρΗ7.0，混合反应5min，再加入0.2mg羊抗免IgG抗体溶液，加无菌水配成100 μ L的标记物溶液，在常温下反应2_4h ;将上述标记物溶液置磁力搅拌器中混匀，反应结束后置于4°C冰箱内过夜，得到CdSe/ZnS量子点标记的羊抗免IgG抗体粗品；3)将CdSe/ZnS量子点标记的羊抗免IgG抗体粗品100 μ L用加样枪放入含有超滤膜的样品储存管中，在另一个管子中放入等量的水作为平衡，在转速为10，OOOrpm，离心时间为20min，离心温度为4°C的离心机中离心；4)在步骤3)的离心结束后，加入PBS缓冲液，按步骤3)的条件重复离心一次；5)在步骤4)离心结束后，向样品储存管中加入100 μ L PBS缓冲液，然后将其倒扣在离心管上，在转速为500rpm，时间为3min，温度为4°C的离心机中离心并回收样品，即为二抗；(3) CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心的制备以抗CrylAb单克隆抗体为一抗，将该一抗与包被缓冲液按体积比1: 1000稀释本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测转基因水稻中CrylAb蛋白的快速简便方法，其特在于如下步骤：(1)抗CrylAb单克隆抗体的制备以CrylAb蛋白为抗原获得兔血清，通过纯化得到抗CrylAb单克隆抗体作为一抗，分泌该单克隆抗体的抗CrylAb单克隆抗体杂交瘤细胞HHX?001保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CTCC?NO：C201214。(2)CdSe/ZnS量子点标记的羊抗免IgG抗体(即二抗)的制备1)将500μL羊抗免IgG抗体溶液分装成10等份的50μL小管子，保存于?20℃冰箱内，待用时取出一小管，置于4℃冰箱处，备用；2)取25μL?CdSe/ZnS量子点母液，20μL?1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)端二亚胺盐酸盐溶液和10μLN?羟基琥珀酰亚胺溶液，pH7.0，混合反应5min，再加入0.2mg羊抗免IgG抗体溶液，加无菌水配成100μL的标记物溶液，在常温下反应2?4h；将上述标记物溶液置磁力搅拌器中混匀，反应结束后置于4℃冰箱内过夜，得到CdSe/ZnS量子点标记的羊抗免IgG抗体粗品；3)将CdSe/ZnS量子点标记的羊抗免IgG抗体粗品100μL用加样枪放入含有超滤膜的样品储存管中，在另一个管子中放入等量的水作为平衡，在转速为10,000rpm，离心时间为20min，离心温度为4℃的离心机中离心；4)在步骤3)离心结束后，加入PBS缓冲液，按步骤3)的条件重复离心一次；5)在步骤4)离心结束后，向样品储存管中加入100μL?PBS缓冲液，然后将其倒扣在离心管上，在转速为500rpm，时间为3min，温度为4℃的离心机中离心并回收样品，即为二抗；(3)CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心的制备以抗CrylAb单克隆抗体为一抗，将该一抗与包被缓冲液按体积比1∶1000稀释，然后加入到酶标板孔中，20℃孵育过夜，次日用PBS缓冲液洗板3次，每次5min，拍干后加封闭缓冲液，每孔200μL，于37℃下静置1h，之后用PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；将CrylAb蛋白溶液用PBS缓冲液稀释至6.0pg/ml、12.5pg/ml、25.0pg/ml、50.0pg/ml、100.0pg/ml、200.0pg/ml梯度浓度后加于包被孔中，每孔100μL，于37℃下静置1h，之后用PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；将纯化后的二抗用PBS缓冲液稀释至10.00ug/mL，加入酶标板的包被孔内.每孔100μL，于37℃下静置1h，之后用PBS缓冲液快速洗涤，得到CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心；(4)绘制CrylAb蛋白的标准曲线将0.4μg/ml的CrylAb蛋白标准溶液稀释为200pg/mL、100，pg/mL、50，pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL和6pg/mL梯度浓度，用CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心检测水稻CrylAb蛋白的含量，以该梯度浓度稀释的CrylAb蛋白溶液浓度为自变量，以 对应的CrylAb蛋白相对荧光强度值减去空白对照相对荧光强度值为应变量，绘制标准曲线，公式如下：Y＝0.0137X+0.02????R2＝0.994，X为系列梯度稀释的CrylAb蛋白溶液浓度为自变量，Y为对应CrylAb蛋白相对荧光强度；(5)用酶标仪检测OD450的值，判定待检测水稻中CrylAb蛋白的含量；其中：所述的CdSe/ZnS量子点母液的组分及配制：称取0.0127g，0.1mmol的CdO和0.11g的硬脂酸放入50mL的三颈瓶中，在氩气保护下，加热至130℃，使CdO充分溶解于硬脂酸中；将温度降至室温后，称取三辛基氧化磷和十六烷基胺各1.5g放入三颈瓶中，搅拌加热到230℃，另称取0.032g，1mmol的硫粉，在氩气保护下，使之溶解于2mL三辛基磷中，抽入5mL的针管中作为储备液；当Cd前驱物温度达到230℃时，将Se粉储备液快速注入三颈瓶后，使温度降至180℃，保持10min，收集CdSe样品溶于氯仿中备用；称取0.632g的硬脂酸锌和0.032g的硫粉分别加入2mL的十八碳烯中加热至120℃充分溶解，分别得到硬脂酸锌溶液和硫粉溶液，降温至70℃，将硬脂酸锌溶液和硫粉溶液混合后于70℃下保存备用；将分散于氯仿中的CdSe样品加入瓶中，加热至120℃保持30min，蒸干氯仿，升温至200℃；抽取硬脂酸锌和硫粉的十八碳烯溶液，以0.2mL/min注入ZnS壳层，注入完成后，升温至230℃保持1h，降温至60℃，反应产物用甲醇沉...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军安，韩宇，华红霞，邹铅，高美虹，陈长水，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：