一种优秀冰雪运动员肌细胞凋亡鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种优秀冰雪运动员肌细胞凋亡鉴定方法。一种优秀冰雪运动员肌细胞凋亡鉴定方法，其实施步骤见具体实施方式部分。本发明专利技术为优秀冰雪运动员肌细胞凋亡鉴定提供了新的研究手段，可定量分析优秀冰雪运动员肌细胞凋亡情况，经电镜检验及Tunel法检验其效果和准确性可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用流式细胞术鉴定优秀冰雪运动员肌细胞凋亡的方法。
技术介绍
细胞凋亡(apoptosis)是一种由基因调控的细胞主动死亡过程,是运动生命活动过程中不可缺少的组成内容。过去人们普遍认为运动造成的肌肉损伤是由于炎症与骨骼肌细胞坏死引起的，而近来国内外的动物实验研究显示，运动后无论是在正常肌肉中还是病理状态下的肌肉中，骨骼肌细胞都出现了凋亡，凋亡的形态学表现与普通凋亡细胞相似，即核固缩、质膜发泡、细胞器的紧缩，凋亡小体形成，同时出现了 Ca2+浓度增加。运动训练会诱发肌细胞产生凋亡是目前世界范围内生物学和医学领域研究的热点。优秀冰雪运动员肌细胞凋亡的鉴定方法主要是利用细胞形态学特点和生化特征来进行的，通常是通过光学显微镜、荧光显微镜和电子显微镜对组织或细胞进行各种染色来观察凋亡现象，其次是采用原位末端标记法(Terminal deoxynucIeotidyl trasnferase-mediated deoxyuridinetriphosphate nick-end labelling assay,TUNEL)和DNA琼脂糖凝胶电泳法来分析凋亡情况，但这些方法都存在检测费用昂贵、主观性太强且不可定量检测等弊端。近年来，随着流式细胞术的不断发展，应用该项技术检测细胞凋亡得到充分的应用。在生物细胞中，DNA含量是比较恒定的参数，DNA含量随着细胞增殖周期各时相变化而发生改变。荧光染料碘化丙唳(Propidium iodide, PI)与细胞DNA具有特异结合的特征,且有一定的量效关系。亚“G1”峰检测法能够定量分析细胞凋亡，处于增殖周期中的细胞，根据其所处的不同周期时相(G0/G1，S，G2/M)，其DNA含量分布在2n_4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段，被乙醇固定后，由于乙醇能迅速溶解细胞膜中的脂质，对细胞产生通透作用(即在细胞膜上形成小孔)，导致小分子量的DNA片段穿过胞膜至乙醇溶液中而丢失，仅剩下大片段DNA，最终导致凋亡细胞内DNA含量减少，荧光强度减小。采用碘化丙啶(Propidiumiodide, PI)染料对凋亡细胞DNA标记，通过流式细胞术进行DNA含量定量分析，在DNA含量和数目组成的直方图中，凋亡细胞表现为G0/G1峰前出现一个小于二倍体含量的峰，即亚二倍体峰，又称凋亡细胞峰，亚Gl峰，根据该峰细胞所占比例，可进行凋亡细胞的定量分析，且该方法操作简便、快捷、准确。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肌细胞凋亡的定量分析方法；提供一种鉴定肌细胞凋亡的方法步骤。附图说明图1流式细胞术检测细胞凋亡时的亚Gl峰门C为凋亡细胞，其数值为凋亡百分比。具体实施例方式肌肉活检部位的选取，肌肉活检选位的原则是注意避开病变部位、表皮血管和皮肤损伤处。常用的肌肉活检部位为:肱二头肌、胫骨前肌、腓肠肌、股四头肌，少数采用肱三头肌、三角肌、岗上肌。常用于肌肉注射的部位不宜做肌肉活检，如臀肌和三角肌。另外，术前肌电图针刺部位也不宜活检，所以如果想用肌电图确定对称性肌肉病的活检部位时，常用右侧肌电图检查，把左侧可能用的肌肉留出来。此外，应避免在靠近肌腱处进行活检，因此处肌纤维常与结缔组织混杂交织存在，且内核肌纤维多，电镜下见Z线扭曲等变化。肌肉活检的方法分为针刺式和开放创口式两种:一、针刺式肌肉活检，样本大约豌豆大小，用一根较大的钻孔针取样，针刺式的创伤较小，所取得的样本较小。活检方法步骤:局麻，手持钻锯针在电视下瞄准位置进针，固定套管拔出针芯，接上电钻或气钻旋转刺入肌肉l-2cm，去掉电钻将针退至套管内一起拔出，用针芯拔出针内肌细胞。二、开放创口式肌肉活检的步骤:常规消毒，铺洞巾。局部麻醉:2%利多卡因5ml加I滴肾上腺素，可以减少术野出血。注意麻醉药不能注入肌肉。切口长度:2-3cm，脂肪层厚的患者切口适当加长，钝性分离皮下组织至深筋膜，切开，分离并充分暴露肌肉组织，确定没有大血管、神经进入肌束，用弯止血钳轻柔挑取肌束，取直径0.5cm，长Icm的肌肉(避免肌肉过度牵拉)，纱布压迫止血，分层缝合深筋膜和皮肤，无菌纱布及弹力绷带加压包扎(可以防止术野渗血，但要在3h后放松，避免包扎部位远端肿胀)。取出肌细胞后进行后续处理:(I)无菌操作，将标本用70%无水乙醇洗涤并置入70%无水乙醇中固定。(2)单细胞悬液的制备，将样品置于培养皿中，同时再加入lml4°C预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS),用剪刀剪碎并过400目筛网。(3) 1200rpm离心8min,弃PBS,用70%乙醇再次固定过夜。(4) 1200rpm离心8min,将上清夜倒掉,加入3ml PBS洗漆细胞，1200rpm离心8min,收集细胞。(5)加入 Iml 碘化丙唳(propidium iodide, PI)染液，4°C避光孵育 30min。(6)上机检测。PI用488nm気离子激光器激发，由630nm带通滤光片接收,通过FSC/SSC散点图收集10000个细胞，采用设门技术排除粘连细胞和碎片，分析PI荧光直方图上凋亡细胞百分率。(结果判定:在FSC/SSC散点图上显示凋亡细胞比正常细胞小(FSC小)；在PI荧光图上G0/G1期峰前面出现亚二倍体峰)。权利要求1.一种优秀冰雪运动员肌细胞核内DNA固定方法，其特征在于肌肉细胞获取后立即置入70%无水乙醇固定。2.一种优秀冰雪运动员肌细胞凋亡定量分析方法，PI染色结合流式细胞术检测亚二倍体峰法。全文摘要本专利技术公开了。，其实施步骤见具体实施方式部分。本专利技术为优秀冰雪运动员肌细胞凋亡鉴定提供了新的研究手段，可定量分析优秀冰雪运动员肌细胞凋亡情况，经电镜检验及Tunel法检验其效果和准确性可靠。文档编号G01N15/14GK103196739SQ20131012168公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月10日 优先权日2013年4月10日专利技术者田小健, 张颖, 李晓东, 王会, 崔鹏, 关伟军 申请人:哈尔滨体育学院本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种优秀冰雪运动员肌细胞核内DNA固定方法，其特征在于肌肉细胞获取后立即置入70％无水乙醇固定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田小健，张颖，李晓东，王会，崔鹏，关伟军，
申请(专利权)人：哈尔滨体育学院，
类型：发明
国别省市：