制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的方法技术

本发明专利技术公开一种生物技术领域的制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的方法，该方法采用一内部有溶液通道的流室，该流室溶液通道上游设有进样口和电泳缓冲液填充口；将含有目的复合物的混合物通过进样口注入流室，同时将电泳缓冲液通过电泳缓冲液填充口注入流室，流室下端有目的复合物收集口和空微纳米珠出口，连接目的复合物收集口的容器连接电源正极，与目的复合物收集容器对应的流室溶液通道另一处连接电源负极；利用外加电场，使目的复合物进入目的复合物收集容器。本发明专利技术获得的目的复合物纯度高、数量多，可用于在单分子水平的核酸-蛋白质相互作用动力学研究、免疫学观察、单分子核酸测序以及新一代测序仪的样品制备等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物
的多聚物制备方法，具体是一种。
技术介绍
经微纳米珠连接单根多聚物(DNA、RNA、蛋白质和肽核酸等)分子进行单分子操纵，可用于检测多种生命现象的单分子基本行为，包括核酸与核酸、核酸与相关蛋白相互作用动力学、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代测序仪的样品制备等。比较常用的办法是采用光学镊和磁镊操纵连接单分子多聚物的微纳米珠，但如何快速和简便制备这种单个微纳米珠连接单根多聚物分子，一直没有很好解决。经对现有文献检索发现，Dapprich, J.&Nicklaus, N 等在《生物成像》上发表了“通过监控珠子位移将DNA连接到被光学捕获在微结构的珠子上”一文(Dapprich, J.&Nicklaus, N.DNA attachment to opticalIy trapped beads inmicrostructures monitored by bead displacement.Bioimaging, 6:25-32, 1998),文中称他们的研究结果可获得一个磁珠只连接一根DNA片段，但该方法需要光学镊，步骤比较繁琐，效率也较低。因此，本专利技术要解决的技术问题是提供快速、简便制备并富集大量的“单个微纳米珠携带单根多聚物分子”(以下称“目的复合物”)的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速、简便，用于在单分子水平研究核酸与相关蛋白分子相互作用动力学、遗传诊断、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代测序仪的样品制备等。本专利技术是通过以下技术方案实现的: 本专利技术提供一种制备与富集单个微纳米珠连接单根多聚物分子的方法，该方法在获得连接单根荧光标记的多聚物分子的单个微纳米珠(目的复合物)和空微纳米珠的混合物后，采用一内部有溶液通道的流室，该流室溶液通道上游有进样口和电泳缓冲液填充口 ；将混合物通过进样口注入流室，同时将电泳缓冲液通过电泳缓冲液填充口注入流室，流室下端有目的复合物收集口和空微纳米珠出口 ；将连接复合物收集口的目的复合物收集容器连接到电源正极，与目的复合物收集容器对应的流室溶液通道另一处连接到电源负极，利用外加电场，使携带净负电荷目的复合物进入目的复合物收集容器。本专利技术方法中，所述获得连接单根荧光标记的多聚物分子的单个微纳米珠(目的复合物)和空微纳米珠的混合物，可以采用现有技术制备，也可以按照以下方法制备:步骤一，在多聚物(包括DNA、RNA、以及二者之一与蛋白质或肽核酸连接后的嵌合体)一端标记一种活性基团，另一端或侧链标记荧光分子，纯化后用连接缓冲液重新溶解；步骤二，采用可与标记核酸活性基团发生反应的另一种活性基团包被的微纳米珠与经步骤一处理过的多聚物混合，通过连接反应将多聚物分子连接到微纳米珠上。为使一个微纳米珠连接的多聚物分子不超过一根，多聚物分子数目与微纳米珠数目的比例按1:^ 10混合，结果是一个微纳米珠上要么只连接一根多聚物分子，要么不连接多聚物分子，没有连接一根以上的微纳米珠，因微纳米珠数目大大超过多聚物分子数，所以，反应后也没有自由的多聚物分子。本专利技术方法中，对于在中性溶液中携带负电荷的核酸分子，可直接按上述步骤实施，对蛋白质和肽核酸等多聚物分子，则需要事先连接一段核酸作为电分离的介体，形成多聚物嵌合体。所述的突光标记，是可以用于突光显微镜观察的一类突光分子。所述的多聚物分子，是核酸(DNA和RNA)、核酸与蛋白质以及核酸与人工合成的肽核酸多聚物连接后的嵌合体。所述的微纳米珠，是单分子多聚物运载工具，其材质可以是硅、磁性材料或多聚物等，其直径在纳米至微米量级。所述的标记多聚物分子和包被微纳米珠的活性基团，是二者能够发生免疫绑定、直接或介导形成共价键的活性基团对，凡是能够实现该目的的活性基团对均可，包括但不限于:生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-环氧基、氨基-羧基(包括羧基的活化形式如琥珀酰亚胺碳酸酯等)、氨基-羰基、巯基-马来酰亚胺、巯基-环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等。包被微纳米珠表面的活性基团可以是中性、酸性或碱性，后两种情况下，连接产物在分离与富集前，用能使之钝化的试剂处理微纳米珠，使微纳米珠表面不携带净电荷。所述的流室，是根据核酸在中性溶液携带负电荷，用核酸电泳和流体力学原理分离目的复合物的装置。样品在通过流室通道时，目的复合物因携带负电荷，在电场作用下，使目的复合物离开溶液通道中的样品液流，进入与其电性质相反的收集容器，实现分离和收集目的复合物，空微纳米珠进入空微纳米珠出口。流室通道的溶液可以进入目的复合物收集容器，也可以不进入目的复合物收集容器，后一种情况下，该容器中事先加满电泳缓冲液。本专利技术方法中，所述的电泳缓冲液，是用于将溶液的pH值维持在近中性范围以分离目的复合物的溶液，可以是Good缓冲液，如25mM Hepes (pH7.5)，IM KC1，或其他电泳缓冲液，如Tris-TAE、Tris-TPE、Tris-TBE或碱性缓冲液等。填充电泳缓冲液起到屏蔽微纳米珠因布朗运动和扩散而进入目的复合物收集口的作用。所述电泳缓冲液流的设置方式可以是侧流方式，也可以是鞘流方式，侧流方式(即填充流)在样品流一侧形成屏蔽液流，鞘流方式则在样品流的四周形成屏蔽液流。填充电泳缓冲液设置为侧流时，目的复合物收集口及空微纳米珠出口的位置分别对应于填充缓冲液进入流室溶液通道时的位置以及样品溶液进入流室溶液通道时的位置；设置为鞘流时，目的复合物出口与空微纳米珠出口分叉即可，不受上游样品和填充电泳缓冲液入口的位置影响。本专利技术方法中，可以在各种条件确定后，计算得到能够将目的复合物牵引至目的复合物收集容器所需的最小外加电场的电压Vmin，也可以通过安装成像系统装备的荧光显微镜，通过显微镜观察得出vmin。在外加电压V > Vmin条件下，均可实现本专利技术的实施效果。本专利技术方法中，进样口和电泳缓冲液填充口可以采用注射泵、蠕动泵或鞘流泵来控制进样速度。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效益:制备出的目的复合物纯度高、数量多，在单分子DNA与相关蛋白分析中，在光学显微镜或荧光显微镜辅助下，直接拾取目的复合物，准确、便捷，不再需要复杂而缓慢的光学镊、磁镊或原子力显微镜操作步骤；目的复合物经修饰可用于在单分子水平研究DNA与相关蛋白相互作用动力学、结合高灵敏纳米孔传感器测序DNA、检测免疫反应以及新一代DNA测序仪的样品制备等。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显:图1为本专利技术一实施例采用的流室装置示意图，其中电泳缓冲液流的设置方式为侧流方式，流室通道中的部分填充电泳缓冲液进入目的复合物收集容器，目的复合物收集容器连接电源正极，溶液通道相对一侧连接电源负极；图2为本专利技术一实施例采用的流室装置示意图，其中电泳缓冲液流的设置方式为侧流方式，流室通道中的部分填充电泳缓冲液进入目的复合物收集容器，目的复合物收集容器连接电源正极，进样口连接电源负极；图3为本专利技术另一实施例采用的流室装置示意图，其中电泳缓冲液流的设置方式为侧流方式，流室通道溶液不能进入目的复合物收集容器，目的复合物收集容器连接电源正极，溶液通道相对一侧连接电源本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的方法，其特征在于，该方法在获得连接单根荧光分子的多聚物分子的单个微纳米珠即目的复合物和空微纳米珠的混合物后，采用一内部有溶液通道的流室，该流室溶液通道上游有进样口和电泳缓冲液填充口；将所述混合物通过进样口注入流室，同时将电泳缓冲液通过电泳缓冲液填充口注入流室，流室下游有目的复合物收集口和空微纳米珠出口；将连接目的复合物收集口的容器连接电源正极，与目的复合物收集容器对应的流室溶液通道另一侧连接电源负极，利用外加电场，使携带净负电荷的目的复合物进入目的复合物收集容器。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王志民，程秀兰，黄伟东，侯彩玲，王跃，张林霞，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：