检测点突变基因的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测点突变基因的方法，以突变基因为模板，通过连接反应将两条与点突变基因互补且相邻的寡核苷酸探针连接成一条完整寡核苷酸链，并在寡核苷酸链上标记电化学发光分子。然后通过磁性微球捕获并分离出完整寡核苷酸链，最后用电化学发光分析仪检测完整寡核苷酸链上标记的电化学发光分子，通过比较待检测基因样品与空白溶液的电化学发光信号强度的差异检测出点突变基因。本发明专利技术还公开了检测点突变基因的试剂盒，包含：两条与点突变基因序列互补的寡核苷酸探针、连接酶、以及表面标记有捕获分子的磁性微球。本发明专利技术检测点突变基因的方法，检测灵敏度高，检测结果准确、可靠，在肿瘤分子诊断、遗传分子诊断等领域有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测点突变基因的方法及试剂盒。
技术介绍
随着分子生物学的发展，越来越多的证据显示恶性肿瘤、遗传性疾病等困扰人类的重大疾病与基因突变存在密切联系，而在基因突变类型中又以点突变最为常见，相关的点突变基因检测技术得到了较快发展。目前，基因测序技术是检测基因突变的“金标准”，但是由于检测突变基因时往往存在野生型基因背景的干扰，测序技术受限于灵敏度，难以检测出丰度低于10%的突变基因。同样由于野生型基因的干扰作用，聚合酶链式反应(PCR)也无法对低丰度的突变基因进行扩增和富集，难以提高突变基因在检测样本中的比例。为了提高点突变基因的检测灵敏度，发展出了基于连接反应的点突变检测技术，包括连接酶检测反应(LDR)和连接酶聚合反应(LCR)。两种方法均采用荧光染料作为信号报告分子，通过检测报告分子的荧光信号获得突变基因的信号，提高了突变基因检测的灵敏度。但是在连接反应中无法分离出突变基因，野生型基因的干扰作用仍无法忽视，限制了检测灵敏度的提高。而且在荧光信号检测过程中，每一条突变基因仅标记一个荧光分子，难以获得足够高的检测信号，容易造成假阴性的结果。此外，由于荧光染料分子往往易于淬灭，也影响了荧光信号检测结果的稳定性。电化学发光技术(ECL)是一种高灵敏检测技术，具有检测结果重复性好，易于自动化等优点，已被用于进行免疫方面的检测，但在基因检测方面的应用很少，主要原因是用电化学发光分子标记基因后难以从反应中分离出来，未标记的基因以及游离的电化学发光分子对检测存在较大干扰，这些因素限制了电化学发光技术在突变检测领域中的应用。专利技术内容本专利技术要解决目前基因 点突变检测灵敏度不高、检测过程易受样本中野生型基因干扰的技术问题，提供一种检测点突变基因的方法，避免了野生型基因的干扰，提高了点突变基因检测的灵敏度。此外，还需要提供一种检测点突变基因的试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:在本专利技术的一个方面，提供了一种检测点突变基因的方法，包括以下步骤:设计两条与点突变基因序列互补且相邻的寡核苷酸探针，即探针I和探针II，其中探针I的5’端标记有识别分子，其3’端的最后一个碱基与点突变的碱基互补配对；探针II的5’端的第一个碱基与点突变碱基相邻的碱基互补配对，其3’端标记有电化学发光分子;将所述寡核苷酸探针与待检测基因混合，该两条寡核苷酸探针以点突变基因为模板，在连接酶的作用下通过连接反应连接成一条完整的寡核苷酸链探针，其5’端标记有识别分子，3’端标记有电化学发光分子；将表面标记有捕获分子的磁性微球与连接反应产物混合，通过捕获分子与识别分子的特异性结合，将连接后完整的寡核苷酸链探针固定在磁性微球的表面；通过外加磁场分离出磁性微球；将分离出的磁性微球加入电化学发光检测池中，用电化学发光检测仪检测连接后完整寡核苷酸链探针上的电化学发光分子信号，通过比较待检测基因样品与空白溶液的电化学发光信号强度的差异检测出点突变基因。所述寡核苷酸探针的长度为15 30bp。所述电化学发光分子包括:金属配合物、鲁米诺、吖啶酯、或光泽精。优选的，所述金属配合物为元素Ru、Os、Cr、Cd、Pd、Pt、Re、Ir、Mo、Tb、Eu、Cu、或Al的金属配合物。优选的，所述金属配合物为三联卩比唳钌(Ru(bpy)3)。所述识别分子包括:生物素、地高辛、与突变基因序列无关的寡核苷酸。所述捕获分子包括:链霉亲和素、抗地高辛抗体、或与寡核苷酸识别分子互补配对的寡核苷酸序列。所述磁性微球的平均直径为0.1-1Oum0优选的，所述磁性微球为超顺磁性微球。所述电化学发光检测池由样品池、三电极工作系统(参比电极、对电极、工作电极)、电子供体三丙胺(Tripropylamine, TPA)组成。在本专利技术的另一方面，还提供了一种检测点突变基因的试剂盒，包含:两条与点突变基因序列互补且相邻的寡核苷酸探针，即探针I和探针II，其中探针I的5’端标记有识别分 子，其3’端的最后一个碱基与点突变的碱基互补配对；探针II的5’端的第一个碱基与点突变碱基相邻的碱基互补配对，其3’端标记有电化学发光分子；连接酶；表面标记有捕获分子的磁性微球，所述捕获分子与寡核苷酸探针上的识别分子特异性结合。本专利技术检测点突变基因的方法，对点突变基因具有极高的检测灵敏度，检测结果准确、可靠，在肿瘤分子诊断、遗传分子诊断等领域有很好的应用前景。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术基于电化学发光反应的点突变基因检测方法示意图；图2是本专利技术实施例1对空白对照、野生型基因、突变型基因的连续5次电化学发光检测结果图。具体实施例方式为了提高大量野生型基因背景下低丰度点突变基因的检测灵敏度，本专利技术研发出了一种检测点突变基因的方法，该方法将对点突变基因具有高度识别性的特异性连接反应与高灵敏电化学发光(ECL)技术有机结合，以点突变基因为模板，通过连接反应将两条相邻的寡核苷酸探针连接在一起，形成一条包括识别分子和电化学发光分子的完整寡核苷酸链，从而把对点突变基因的检测转化为对连接后完整寡核苷酸链的检测。然后用磁性微球捕获、分离完整寡核苷酸链，最后采用电化学发光方法检测完整寡核苷酸链上的电化学发光分子信号，从而检测出点突变基因。如图1所示，本专利技术基于电化学发光反应的检测点突变基因的方法，包括以下步骤:(I)设计两条与点突变基因完全互补的寡核苷酸探针(探针I和探针II )，长度均为10 30bp。其中探针I的3’端最后一个碱基与点突变的碱基互补配对，在这条探针的5’端标记有识别分子，用于后续反应中与磁性微球结合。识别分子包括生物素、地高辛、或与突变基因序列无关的寡核苷酸。探针II与突变基因互补配对后，与探针I相邻，且其5’端处于与发生点突变的碱基相邻的位置，其3’端标记有电化学发光分子，该电化学发光分子包括:元素Ru, Os, Cr, Cd, Pd, Pt, Re, Ir, Mo, Tb, Eu, Cu, Al的金属配合物、鲁米诺、B丫唆酷、或光泽精。(2)将寡核苷酸探针与待检测基因混合，在连接酶的作用下进行连接反应，以点突变基因为模板，两条寡核苷酸探针连接成一条完整的寡核苷酸链探针，其3’端标记有电化学发光分子，5’端标记有识别分子；而野生型基因则由于错配的存在，无法进行连接反应。经过连接反应后，对突变基因的检测被转化为对连接后完整寡核苷酸链探针的检测。(3)将表面标记了捕获分子的磁性微球与连接反应产物混合，磁性微球表面的捕获分子可以与连接在寡核苷酸探针上的识别分子发生特异性结合，从而将连接后完整的寡核苷酸链探针固定在磁性微球的表面。捕获分子包括:链霉亲和素、抗地高辛抗体、或与寡核苷酸识别分子互补配对的寡核苷酸序列。(4)在外加磁场的作用下，连接后的完整寡核苷酸链探针结合在磁性微球的表面，被磁场吸附，从液相中分尚出来。(5)将分离出来的磁性微球加入到电化学发光检测池中，用电化学发光检测仪检测连接后完整寡核苷酸链探针上标记的电化学发光分子信号，通过比较待检测基因样品与空白溶液的电化学发光信号强度的差异检测出样品中微量的点突变基因。实施例1本专利技术方法对点突变基因的检测1.设计两条特异性探针针对P53基因的常见突变位点Y220本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测点突变基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：设计两条与点突变基因序列互补且相邻的寡核苷酸探针，即探针Ⅰ和探针Ⅱ，其中探针I的5’端标记有识别分子，其3’端的最后一个碱基与点突变的碱基互补配对；探针Ⅱ的5’端的第一个碱基与点突变碱基相邻的碱基互补配对，其3’端标记有电化学发光分子；将所述寡核苷酸探针与待检测基因混合，该两条寡核苷酸探针以点突变基因为模板，在连接酶的作用下通过连接反应连接成一条完整的寡核苷酸链探针，其5’端标记有识别分子，3’端标记有电化学发光分子；将表面标记有捕获分子的磁性微球与连接反应产物混合，通过捕获分子与识别分子的特异性结合，将连接后完整的寡核苷酸链探针固定在磁性微球的表面；通过外加磁场分离出磁性微球；将分离出的磁性微球加入电化学发光检测池中，用电化学发光检测仪检测连接后完整寡核苷酸链探针上的电化学发光分子信号，通过比较待检测基因样品与空白溶液的电化学发光信号强度的差异检测出点突变基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程昌明，汪杰，杨超，
申请(专利权)人：上海生物芯片有限公司，
类型：发明
国别省市：