一种激酶抑制剂对结肠癌细胞活性的检测方法，主要从两个部分进行，第一部分，采用MTT比色法考察不同浓度的海绵来源化合物BA对肿瘤细胞增殖的影响筛选出对激酶抑制剂最敏感的癌细胞株；第二部分，建立肿瘤动物模型，考察激酶抑制的体内抗肿瘤活性，皮下接种建立裸鼠肿瘤模型，考察海绵来源化合物BA体内的抗肿瘤效应，并评价其体内的毒副作用。本发明专利技术评价方式周全，结论精确，可有效应用于临床。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域，尤其涉及一种用于海洋生物制剂对结肠癌细胞活性的研究的激酶抑制剂对结肠癌细胞活性的检测方法。
技术介绍
恶性肿瘤是威胁人类生命、引发死亡的重大疾病。目前研究较深入的靶点主要针对肿瘤细胞自身特点的生长抑制、肿瘤血管新生、人体免疫系统、DNA与蛋白质合成等。近年来，靶向抗肿瘤新药的研发与创制进展迅速，其中有机小分子化合物从最初的细胞毒作用逐渐发展到目前作为各类靶点的抑制剂，始终是抗肿瘤药物的研究热点。陆生资源日益枯竭，陆地植物中寻求新骨架化合物几率急剧下降。海洋生物的多样性及环境高盐、高压、缺氧和避光的特点导致海洋生物次级代谢产物的生物合成途径及酶催化反应机制方面具有特异性，成为新药和先导化合物的来源。近年来，海洋生物的提取产物为新药研制提供了大量的先导化合物，但是这些提取物的抗癌谱窄，多数缺乏靶向性，因此从海洋中分离提取出结构新颖、抗癌谱广的靶向抗肿瘤药物是抗肿瘤药物开发的重点领域。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题在于提供系统，以解决上述
技术介绍
中的缺点。本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现: ，主要从两个部分进行，第一部分，筛选出对激酶抑制剂最敏感的 癌细胞株；第二部分，建立肿瘤动物模型，考察激酶抑制剂的体内抗肿瘤活性。其中，在第一部分中，采用MTT法来研究激酶抑制剂对癌细胞株活性的影响。四唑盐的还原是目前被广泛的一种可靠的检测细胞增殖的方法，MTT(3-(4,5-dimethylthiazolyl_2)-2，5-diphenyltetrazoIium bromide)可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量，具体操作如下: I)培养细胞:采用含10%胎牛血清的培养基(人结肠癌SW620细胞与人肺腺癌A549细胞的培养基是RPM1-1640，宫颈癌Hela细胞的培养基是高糖DMEM)，于37°C、5%C02的培养箱中贴壁培养。2)接种细胞:用胰酶消化液消化，形成单细胞悬液。取一定量对数生长期SW620细胞、Hela细胞和A549细胞)接种于96孔板中，于37°C，5%C02的培养箱中培养，过夜。3)药物配制:将激酶抑制剂用DMSO溶解，配制激酶抑制剂的母液(6.4X105ymol/L)。用细胞培养液稀释母液，最终配制浓度为0.5、1、2、4、8、16、32、64μπι01/1的激酶抑制剂培养液，DMSO的最终含量=0.1%。4) MTT溶液的配制:无菌条件下，在50ml离心管中加入20ml磷酸盐缓冲液，从中先吸取Iml磷酸盐缓冲液装入含MTT的小管中，使MTT尽量溶解，再转移到50ml离心管中，用纯净的磷酸盐缓冲液涮洗小管3次，将洗液混合后，定容到50ml，用0.22μπι滤膜过滤以除去溶液里的细菌，避光分装成Iml/管，(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。5)药物干预:吸除96孔板中旧细胞培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2遍，添加含药物培养液干预细胞，同时设置阴性对照孔和调零孔，每个浓度设置6个复孔。6)分别培养24、48、72 h后，去除旧培养基，每孔添加200 UL不含血清的培养基和20 μ L MTT溶液，于37°C，5%C02的培养箱中避光孵育4飞h。7)小心吸除原液后，每孔添加150 μ L DMS0，摇床上轻摇10 min, ELx 800 NB酶标仪检测490 nm波长下的吸光值(0D)，计算抑制率与半数抑制浓度IC50 (IC50指细胞增殖抑制率为50%时药物的干预浓度)。[0014 算公式为:权利要求1.，其特征在于，主要从两个部分进行，第一部分，筛选出对激酶抑制剂最敏感的癌细胞株；第二部分，建立肿瘤动物模型，考察激酶抑制的体内抗肿瘤活性； 其中，在第一部分中，采用MTT法来研究激酶抑制剂对癌细胞株活性的影响，具体操作如下: ·O培养细胞:采用含10%胎牛血清的培养基，于37°C、5%C02的培养箱中贴壁培养； ·2)接种细胞:用胰酶消化液消化，形成单细胞悬液，取一定量对数生长期SW620细胞、Hela细胞和A549细胞)接种于96孔板中，于37°C，5%C02的培养箱中培养，过夜； ·3)药物配制:将激酶抑制剂用DMSO溶解，配制含6.4X105 μ mo I/L激酶抑制剂作为母液，用细胞培养液稀释母液，最终配制浓度为0.5、1、2、4、8、16、32、64μπι01/1的激酶抑制剂培养液，DMSO的最终含量=0.1% ； ·4)MTT溶液的配制:无菌条件下，在50ml离心管中加入20ml磷酸盐缓冲液，从中先吸取Iml磷酸盐缓冲液装入含MTT的小管中，使MTT尽量溶解，再转移到50ml离心管中，用纯净的磷酸盐缓冲液涮洗小管3次，将洗液混合后，定容到50ml，用0.22 μ m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，避光分装成Iml/管，并保存于-20度； · 5)药物干预:吸除96孔板中旧细胞培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2遍，添加含药物培养液干预细胞，同时设置阴性对照孔和调零孔，每个浓度设置6个复孔； · 6)分别培养24、48、72h后，去除旧培养基，每孔添加200 μ L不含血清的培养基和·20 μ L MTT溶液，于37°C，5%C02的培养箱中避光孵育4飞h ； ·7)小心吸除原液后，每孔添加150yLDMS0，摇床上轻摇10 min，ELx 800 NB酶标仪检测490 nm波长下的吸光值，计算抑制率与半数抑制浓度IC50， 其计算公式为:全文摘要，主要从两个部分进行，第一部分，采用MTT比色法考察不同浓度的海绵来源化合物BA对肿瘤细胞增殖的影响筛选出对激酶抑制剂最敏感的癌细胞株；第二部分，建立肿瘤动物模型，考察激酶抑制的体内抗肿瘤活性，皮下接种建立裸鼠肿瘤模型，考察海绵来源化合物BA体内的抗肿瘤效应，并评价其体内的毒副作用。本专利技术评价方式周全，结论精确，可有效应用于临床。文档编号A61K49/00GK103194521SQ20131005581公开日2013年7月10日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日专利技术者杨凤, 袁洪, 黄志军, 阳国平, 蒋宇扬, 高春梅, 唐劲天 申请人:中南大学湘雅三医院本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种激酶抑制剂对结肠癌细胞活性的检测方法，其特征在于，主要从两个部分进行，第一部分，筛选出对激酶抑制剂最敏感的癌细胞株；第二部分，建立肿瘤动物模型，考察激酶抑制的体内抗肿瘤活性；其中，在第一部分中，采用MTT法来研究激酶抑制剂对癌细胞株活性的影响，具体操作如下：1）培养细胞：采用含10%胎牛血清的培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中贴壁培养；2）接种细胞：用胰酶消化液消化，形成单细胞悬液，取一定量对数生长期SW620细胞、Hela细胞和A549细胞）接种于96孔板中，于37℃，5%CO2的培养箱中培养，过夜；3）药物配制：将激酶抑制剂用DMSO溶解，配制含6.4×105?μmol/L激酶抑制剂作为母液，用细胞培养液稀释母液，最终配制浓度为0.5、1、2、4、8、16、32、64μmol/L的激酶抑制剂培养液，DMSO的最终含量≦0.1%；4）MTT溶液的配制：无菌条件下，在50ml离心管中加入20ml磷酸盐缓冲液，从中先吸取1ml磷酸盐缓冲液装入含MTT的小管中，使MTT尽量溶解，再转移到50ml离心管中，用纯净的磷酸盐缓冲液涮洗小管3次，将洗液混合后，定容到50ml，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，避光分装成1ml/管，并保存于?20度；5）药物干预：吸除96孔板中旧细胞培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2遍，添加含药物培养液干预细胞，同时设置阴性对照孔和调零孔，每个浓度设置6个复孔；6）分别培养24、48、72?h后，去除旧培养基，每孔添加200?μL不含血清的培养基和20μL?MTT溶液，于37℃，5%CO2的培养箱中避光孵育4~6?h；7）小心吸除原液后，每孔添加150μL?DMSO，摇床上轻摇10?min，ELx?800?NB酶标仪检测490?nm波长下的吸光值，计算抑制率与半数抑制浓度IC50，其计算公式为：????????????????????????????????????????????????其中，IC50值通过Excel模拟出趋势线，得到趋势线的公式，计算IC50值，以该浓度作为后续实验的干预浓度；而在第二部分中，采用激酶抑制剂对裸鼠结肠癌生长的抑制作用进行操作，采用的是皮下接种人结肠癌细胞悬液，直接建立结肠癌动物模型，具体操作步骤如下：1）复苏结肠癌细胞，采用含10%胎牛血清的RPMI?1640培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中贴壁培养；2）用胰酶消化液正常消化传代3?4次，取生长状态良好的细胞，胰酶消化，1000r/min离心5分钟，弃旧培基，收集细胞，采用无血清的培养基重悬细胞，Bio?Tek自动细胞计数仪计数，调整细胞浓度至3×107～5×107个/ml；3）于每只裸鼠右腋皮下接种0.1ml细胞悬液，每隔一天测量裸鼠的体重及肿瘤最长径和最短径，计算裸鼠的肿瘤体积大小；4）待肿瘤生长到100～150?mm3大小，随机将裸鼠分为4组，每组5只，连续5天给药，每天给药一次，常规饲养，饮水食物不限；5）每隔一天测量裸鼠的体重及肿瘤最长径和最短径，计算裸鼠的肿瘤体积大小，每天监测老鼠体重，并观察小鼠的行为活动和生命体征，包括肤色、大便、瘤体大小等，记录裸鼠的生存时间；6）实验结束，称体重，解剖裸鼠，PBS灌注，4%多聚甲醛固定，取裸鼠的肿瘤组织，称重，按照下面公式计算抑瘤率，评价标准：抑瘤率（%）40视为有效。840560dest_path_image001.jpg,39460dest_path_image002.jpg...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨凤，袁洪，黄志军，阳国平，蒋宇扬，高春梅，唐劲天，
申请(专利权)人：中南大学湘雅三医院，
类型：发明
国别省市：
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