本发明专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法。本发明专利技术的基因来源于枯草芽孢杆菌，为SEQIDNO1所示的碱基序列。该基因编码谷氨酰胺合成酶，能够显著提高模式生物大肠杆菌合成谷氨酰胺的能力。这预示了所公开的全长基因及氨基酸序列，在提高生物体的氮利用效率和增加生物体氮元素含量的基因工程方面具有应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法，特别是一种。
技术介绍
氮元素是生物体必须也是需求量最大的矿物质元素，用于合成生物体所需的氨基酸和核苷酸及多种不同的含氮化合物。氮的利用在农作物生产中占非常重要的地位，植物氮代谢及其调控一直备受全世界关注，氮肥利用率低及过量施用氮肥造成水环境污染的问题也是世界性难题。谷氨酰胺合成酶是植物氮同化过程的关键酶，通过植物基因工程方法研究GS在植物氮素营养代谢中的作用，改变植物氮代谢途径中GS在氮同化中的表达水平,或在植物中异位表达其他物种来源的基因，如细菌等的氮同化和利用的酶来增加额外的氮同化途径，可达到提高植物氮素同化和利用能力，促进植物生长目的。土壤中含有种类丰富的细菌类群。细菌的谷氨酰胺合成酶涵盖了目前所发现的三大类谷氨酰胺合成酶GS1、GSII和GSIII，相比高等植物的谷氨酰胺合成酶基因而言，有种类多和容易克隆的优越性。枯草芽孢杆菌是一种常见的土壤细菌，其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鉴定对于鉴定氮高效基因并应用于逆境下农作物的生理性状改善有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供了一种枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因。 本专利技术的目的之二在于提供了该基因的编码蛋白。本专利技术的目的之二在于提供了该基因的克隆方法。为达到以上目的，本专利技术通过下述方案实现: 一种枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于该基因的序列为SEQ ID N0.1所不的喊基序列。一种上述的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白的序列为SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。一种克隆上述的不枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为:参考NCBI数据库中的不动杆菌属细菌的不枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因序列，设计了兼并引物，从土壤微生物宏基因组DNA中PCR扩增得到不枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因；所述的兼并引物为:BsF: 5’ -ATGGCAAAGTACACTAGAGA-3’和BsR:5’ -TTAATAYTGAGACATATACT-3’。上述的PCR扩增的条件为:94°C 5分钟；94°C 50秒，45°C 50秒，72°C I分30秒，25个循环；72°C 8分钟。本专利技术的互补实验验证了谷氨酰胺合成酶基因GrassBs所编码的谷氨酰胺合成酶能够在大肠杆菌中发挥谷氨酰胺合成酶的功能，能恢复大肠杆菌突变体合成谷氨酰胺的能力，同时也预示了它在其他生物氮高效利用方面的应用价值。附图说明图1和2为本专利技术的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白亚细胞定位预测图，表明该编码蛋白定位在细胞质的可能性很大； 图3为本专利技术的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白的进化分析图，表明该编码蛋白属于谷氨酰胺合成酶家族； 图4为本专利技术的谷氨酰胺合成酶基因在大肠杆菌突变体ET6017 (Genotype:F-, B/r, A (argF-lac)169, flhD5301, A (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR), A (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互补分析图。培养基中添加谷氨酰胺，转入GrassBs和未转入GrassBs的菌株均可以正常生长； 图5为本专利技术的谷氨酰胺合成酶基因在大肠杆菌突变体ET6017 (Genotype:F-, B/r, A (argF-lac)169, flhD5301, A (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR), A (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互补分析图。培养基中未添加谷氨酰胺，只有转入Cra1S1Sife的菌株可以正常生长。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)》，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一 -.GrassBs基因全长编码区的克隆与分析: 通过参考NCBI数据库中的枯草芽孢杆菌UaciJJy1S subtil is)的谷氨酰胺合成酶基因序列，设计了 兼并引物，该引物为:BsF: 5 ’ -ATGGCAAAGTACACTAGAGA-3 ’和BsR:5’ -TTAATAYTGAGACATATACT-3’，从土壤微生物宏基因组DNA中PCR扩增出了一个谷氨酰胺合成酶基因，命名为Cral5lSfc。将该基因插入克隆载体pMD18-T，挑选相应的阳性克隆，对该基因进行了全长DNA测序，获得了含有该基因完整ORF的DNA序列。测序结果表明-.GrassBs的ORF全长1335bp。DNAstar软件的分析结果显示:该基因编码一个含444个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小约为50.3kDa，等电点为4.99。利用Cell-PLoc网站的Gpos-PLoc 2.0以及Softberry网站的ProtComp Version 9.0软件对GrassBs基因编码的蛋白进行亚细胞定位预测，预测数据显示该蛋白定位在细胞质的可能性很大，参见图1和2，这与其它物种中的谷氨酰胺合成酶的定位信息相符。进化分析表明，基因编码的蛋白属于谷氨酰胺合成酶家族，参见图3。实施例二 -.GrassBs在大肠杆菌突变体中的功能分析 通过DNA测序分析，挑选GrassBs基因ORF转录方向与载体pMD 18-T上乳糖启动子转录方向一致的克隆,抽提该克隆的质粒,并转入大肠杆菌突变体ET6017 (Genotype:F-, B/r, A (argF-lac)169,flhD5301, A (fruK-yeiR)725 (fruA25),relAl,rpsL150 (strR)，A (glnG-glnA) 229，ha_10, deoCl)中。请参见文献:Merida, A., Flores E.,Florencio F.J., Regulation of Anabaena sp.strain PCC7120 glutamine synthetaseactivity in a Synechocystis sp.strain PCC6803 derivative strain bearing theAnabaena glnA gene and a mutated host glnA gene.J Bacteriol，1992，174(2):650-654.。该突变体由于缺失编码谷氨酰胺合成酶的基因，所以在不添加谷氨酰胺的培养基中无法正常生长。该菌株购买于E.coli Genetic Stock Center, Yale University。由图4和图5说明GrassBs能够互补大肠杆菌突变体ET6017的谷氨酰胺合成酶缺失表型。GrassBs的表达，使得大肠杆菌突变体ET6017在不添加谷氨酰胺的培养条件下生长。该互补实验在大肠杆菌中验证了基因GrassBs所编码的谷氨酰胺合成酶能本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于该基因的序列为SEQ?ID?NO.1所示的碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱晨光，沈春磊，王伟，叶先敏，王珊珊，唐远平，梅冰，宋任涛，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。