本发明专利技术公开了一种高生物量和/或高叶黄素产量转基因小球藻及其制备方法。本发明专利技术提供了一种培育转基因小球藻的方法，为将透明颤菌血红蛋白编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的生物量和/或叶黄素产量大于所述目的小球藻；所述透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术将透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒导入野生型小球藻中，得到转基因小球藻，该转基因小球藻的生物量与野生型相比显著提高，提高了38.81%；叶黄素含量和野生型相比略有提高，提高了5.93%；叶黄素产量和野生型相比提高了47.19%，为高生物量和叶黄素产量小球藻。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种。
技术介绍
小球藻是一种单细胞微藻，其含有丰富的氨基酸、蛋白质、脂肪酸及类胡萝卜素等生物活性物质。小球藻所含的类胡萝卜素以叶黄素为主，叶黄素具有抗氧化活性，能够预防癌症、心血管疾病和年龄相关黄斑变性等疾病。由于小球藻具有生长速度快、可异养培养、易于进行规模化培养和藻种改良等优点，利用小球藻合成叶黄素越来越受人们的关注。透明颤菌血红蛋白(VHb)是一种氧结合蛋白，在限氧条件下可以促进氧的运输并减少耗氧量，从而提高细胞的呼吸作用和代谢水平。目前，人们对透明颤菌血红蛋白基因(Vgb)进行了大量研究，该基因已经在细菌、真菌和植物中成功表达。研究结果表明Vgb基因的表达能够促进细胞的生长、提高目的代谢物的产量和提高细胞的抗逆性。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种培育转基因小球藻的方法。本专利技术提供的方法，为将透明颤菌血红蛋白编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的生物量和/或叶黄素产量大于所述目的小球藻；所述透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述方法中，所述透明颤菌血红蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第545-985位核苷酸。上述方法中，所述透明颤菌血红蛋白编码基因以透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒的形式导入目的小球藻。所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、透明颤菌血红蛋白编码基因和CYCl终止子。所述透明颤菌血红 蛋白编码基因表达盒的核苷酸序列具体为序列表中的序列I。上述方法中，所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒通过重组载体导入目的小球藻。所述重组载体为将所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301 ;在本专利技术的实施例中，所述重组载体具体为将序列表中序列I所示的核苷酸插入PCAMBIA2301载体的Hind III和BamH I酶切位点间得到的载体。上述方法中，所述重组载体通过重组菌导入目的小球藻；所述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌中得到的重组菌。上述宿主菌具体为农杆菌LBA4404。上述方法中，导入的方法包括如下步骤:用重组农杆菌侵染目的小球藻的原生质体；所述重组农杆菌为将所述重组载体导入农杆菌得到的。上述目的小球藻为小球藻ST1002CGMCC N0.6951。上述生物量为藻体冷冻干燥后的干重由上述方法得到的转基因小球藻也是本专利技术保护的范围。小球藻ST1002已于2012年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCCN0.6951,建议的分类命名为 Chlorella vulgaris。本专利技术的另一个目的是提供一种重组载体。本专利技术提供的重组载体，为将透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301。所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、透明颤菌血红蛋白编码基因和CYCl终止子。 所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒的核苷酸序列具体为序列表中的序列I。本专利技术的第三个目的是提供一种重组菌。本专利技术提供的重组菌，为将上述的重组载体导入宿主菌中得到的重组菌。上述宿主菌具体为农杆菌LBA4404。上述的转基因小球藻、上述的重组载体或上述的重组菌在制备叶黄素中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的第四个目的是提供一种生产叶黄素的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤:I)培养由上述方法得到的转基因小球藻或上述的转基因小球藻，收集藻液中的藻体，得到培养后转基因小球藻；2)将所述培养后转基因小球藻在无水乙醇中超声破碎，再加入KOH水溶液后超声皂化，得到溶液A ;3)将所述溶液A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到叶黄素。上述方法具体如下:I)在FC培养基中培养(具体为28°C、180r/min摇床培养5天)由上述方法得到的转基因小球藻或上述的转基因小球藻，收集藻液中的藻体(具体为8000r/min离心收集lOmin)，得到培养后转基因小球藻；再将培养后转基因小球藻干燥后研磨为粉；2)将经过上述I)处理后的培养后转基因小球藻在无水乙醇中超声(超声功率210瓦，为连续超声温度35°C)破碎30min ;再加入20% (质量百分含量)KOH水溶液超声皂化(超声功率210瓦，为连续超声温度35°C ) IOmin ;得到溶液A ；3)将溶液A加入二氯甲烷和蒸馏水萃取，收集二氯甲烷相，蒸发干燥二氯甲烷，即得到叶黄素。本专利技术的实验证明，本专利技术将颤菌血红蛋白编码基因表达盒导入野生型小球藻中，得到转基因小球藻，该转基因小球藻的生物量和野生型小球藻相比提高了 38.81%，叶黄素含量和野生型小球藻相比提高了 5.93%，叶黄素产量和野生型相比提高了 47.19%。附图说明图1为重组质粒pCAMBIA2301-vgb的构建过程示意图图2为转vgb小球藻的表型鉴定结果左图为小球藻原生质体与农杆菌共培养后涂布于筛选培养基有藻落长出，右图为小球藻原生质体未与农杆菌共培养涂布于筛选培养基没有藻落长出图3为转Vgb小球藻在筛选培养基中进一步鉴定图4为PCR验证转vgb小球藻中vgb基因的插入情况图5为PCR验证转vgb小球藻中NPT II基因的插入情况图6为转vgb小球藻和野生型小球藻的生物量示意图图7为转vgb小球藻和野生型小球藻的叶黄素含量示意图图8为转vgb小球藻和野生型小球藻的叶黄素产量示意图具体实施方式以下实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中所用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。 克隆载体pBluescript II SK+:Stratagene, Catalog Number#212205o双兀载体pCAMBIA2301:CAMBIA, Canberra, Australia。质粒pGAPZ a A:1nvitrogen, Catalog Number V205-20。农杆菌菌株LBA4404:1nvitrogen, Catalog Number 18313-015 酶处理液:由溶质和溶剂组成；溶剂为20mM磷酸盐缓冲液(pH5.8)，其中溶质及其终浓度如下:2% (质量百分比)纤维素酶(上海生工，CLS002610)，2% (质量百分比)蜗牛酶(上海生工,SB0870)和 0.2M KCl。FC培养基:由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下:葡萄糖10g/L、胰蛋白胨2g/L、牛肉浸膏 lg/L、酵母浸膏 lg/L、FeSO4.7H20 2mg/L。TYNG培养基:由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下:10g/L蛋白胨、5g/L牛肉浸膏、5g/葡萄糖、0.2g/L 的 MgSO4.7H20，其余为水；pH7.5。頂培养基:由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下=NaCl 0.15g/L、MgSO4.7Η200.25g/L、K2HP042.28g/L、KH2PO4L 36g/L、CaCl2.H2O0.078g/L、FeSO40.0025g/L、(NH4) 2S040.53g/L、葡萄糖 1.98g/L、甘油 0.54g/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种培育转基因小球藻的方法，为将透明颤菌血红蛋白编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的生物量和/或叶黄素产量大于所述目的小球藻；所述透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林祥志，马瑞娟，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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