本发明专利技术属于植物基因工程技术领域。从甘蓝型油菜中克隆得到一个缺磷诱导表达启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1中第1-1459碱基所示。将该启动子与报告基因GUS融合转化拟南芥，GUS组织化学分析表明该启动子只在缺磷条件下具有活性，在正常、缺氮、缺钾、缺硫以及缺铁条件下都不具有活性。该启动子除了应用于耐低磷或磷高效作物的培育外，还可以用于缺磷诱导表达基因调控机制研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种油菜BnPR2基因启动子及其应用，本专利技术提供了一个油菜缺磷诱导表达启动子及应用。
技术介绍
磷是植物生长发育必需的大量营养元素，它不仅是植物体内核酸、磷脂、ATP等重要分子的组成成分，而且在能量传递和代谢途径调控中发挥着一系列重要作用。植物主要利用根以磷酸根的形式吸收磷。虽然土壤中磷的总量非常丰富，但由于磷酸根很容易被土壤颗粒以及金属离子吸附固定，所以土壤中磷的生物有效性非常低，缺磷经常成为限制作物产量的因素。施用磷肥成为目前保障作物产量的重要栽培措施。然而，施入土壤的磷肥当季利用率很低，往往随水土淋失而进入水体，造成了潜在的水体富营养化等环境问题。另外，磷矿属不可再生资源，估计60-90年后，易于开采的磷矿将被耗竭。为了实现农业的可持续发展，必须提高磷肥的利用效率，减少磷肥的施用量。培育耐低磷或磷高效的作物品种是一项经济有效且环境友好的办法。Gao等(Gao N, Su Y，Min J，Shen W,Shi ff.Transgenic tomato overexpressing ath_miR399d has enhanced phosphorusaccumulation through increased acid phosphatase and proton secretion as well asphosphate transporters.Plant and Soil, 2010, 334:123-136)将拟南芥miR399d 在番爺中超表达。转基因植株提高了磷转运子的表达，磷酸酶的活性和质子的分泌，最终表现出较高的憐吸收和叶片憐浓度。Li!等(LiiJ, Gao X, Dong Z, YiJ, An, L.1mproved phosphorusacquisition by tobacco through transgenic expression of mitochondrial malatedehydrogenase from Penicillium oxalicum.Plant Cell Reports, 2012, 31:49-56)的石开究表明，超表达线粒体苹果酸脱氢酶(MDH)的转基因烟草提高了对铝磷、铁磷和钙磷的利用能力，增加了对的磷吸收，累积了更多的生物量。现有的植物基因工程通常采用CaMV 35S、Ubi和Actl等组成型启动子。由于组成型启动子在不同组织和不同环境 条件下都能驱动下游基因的表达。这不仅浪费能量，而且影响植物正常的生理代谢。因此通过诱导型启动子或组织特异型启动子控制实现导入基因的环境诱导表达或组织特异表达具有重要意义。诱导型启动子(inducible promoter)在正常生长条件下不驱动下游基因的转录或者转录水平很低，而在某些物理、化学或生物信号的刺激下，可以大幅度地提高基因的转录水平。诱导型启动子的优势在于可根据需要在植物特定的发育阶段或生长环境，让其接受外界信号而激活下游基因表达；也可以去除诱导信号，停止目的基因表达。诱导型启动子在基础研究和生产实践中均具有重要的应用价值。本专利技术人通过研究甘蓝型油菜缺磷诱导表达基因，获得了一个缺磷诱导表达启动子，该启动子能够用于耐低磷或磷高效作物的培育，也可以用于缺磷诱导表达基因调控机制研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一个缺磷诱导表达启动子，该启动子来源于甘蓝型油菜(Brassica napus),其位于基因BnPR2的上游。本专利技术所涉及的技术方案是:利用甘蓝型油菜缺磷诱导表达基因BnPR2的基因组序列在芸薹属序列数据库中进行BLAST分析，获得与BnPR2序列一致的白菜BAC。根据BAC序列设计引物，扩增BnPR2的上游序列。然后将该序列与报告基因⑶S融合，构建重组表达载体PBnPK2:⑶S，通过农杆菌介导转化拟南芥，经过抗生素筛选，PCR鉴定获得含有BnPR2启动子的转基因植株。在正常和缺磷、缺氮、缺钾、缺硫、缺铁条件下培养转基因植株，检测不同缺素植株的GUS活性，结果只有缺磷植株显蓝色，正常和其它元素缺乏植株没有蓝色显现，说明BnPR2启动子具有缺磷诱导性。更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。附图说明序列表SEQ ID NO:1是本专利技术克隆的甘蓝型油菜缺磷诱导表达启动子的核苷酸序列，其中l_1459bp是本专利技术的启动子序列，第1460-1501是基因BnPR2的部分核苷酸序列。图1是重组表达载体PBnPK2:GUS的T-DNA区示意图。该载体含卡那霉素(Kna)抗性筛选基因。图2是ΡΒηΡΚ2:⑶S表达载体的酶切鉴定图。图3是不同元素缺乏条件下P_2:GUS转基因拟南芥的⑶S染色结果。其中A，为缺氮处理；B为缺磷处理；C为缺钾处理；D为缺硫处理；E为缺铁处理；F为对照。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但不是限制本专利技术。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，例如参见《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，北京)。引物合成由北京奥科生物技术有限责任公司完成，序列测定由华大基因科技股份有限公司武汉测序部完成。实施例lBnPR2启动子的克隆(I)基因BnPR2是专利技术人从甘蓝型油菜(Brassica napus,鄂油长荚；刘定富等，甘蓝型油菜特长荚突变体的发现和鉴定.湖北农学院学报，1994，14(2):1-5)中分离到的一个缺磷诱导表达基因。正常条件下在油菜根中检测到该基因微弱表达，在叶片中没有检测到表达；缺磷条件下该基因在根和叶中表达量急剧上升。通过对BnPR2的基因序列进行 BLAST 分析(http: //brassica.bbsrc.ac.uk/BrassicaDB/blast_form.html)，在BrassicaDB数据库中找到与BnPR2序列一致的白菜BAC (登录号为⑶695313)。根据该BAC序列设计下列引物对:PF: 5 ’ -CCTGCAGGAATTTTAGAATGTTGTGTCG-3，，PR: 5 ’ -TCTAGATCTTTTGATTTGTGGTGTTGTGC-3，。其中带下划线的碱基为添加的限制性内切酶位点，引物PF添加了一个Sda I酶切别位点，引物PR添加了一个Xba I酶切位点。以甘蓝型油菜 (鄂油长荚)基因组DNA为模板，利用高保真DNA聚合酶KOD plus扩增基因BnPR2的上游序列。PCR反应体系为:DNA (50ng/ μ L) 4.0 μ L，ddH20 9.0 μ L, IOX PCR 缓冲液 2.0 μ L, MgSO4 (25mM) 1.0 μ L，dNTP(2.0mM)2.0μ L,引物 PF (10 μ Μ) 0.8 μ L，引物 PR(10 μ Μ) 0.8 μ L，KOD-plus (IU/μ L) 0.4 μ L0 PCR缓冲液，MgSO4, dNTP，KOD-plus DNA聚合酶均来自东洋纺(上海)生物科技有限公司。PCR反应条件为:94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，58°C退火30秒，68°C延伸2分钟，35个循环；最后68°C保温5分钟。PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，得到大小为1500bp左右的单一条带。(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个甘蓝型油菜缺磷诱导表达的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐芳森，杨广哲，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。