本发明专利技术公开了一种体外高密度培养红细胞的装置，包括搅拌式生物反应器和中空纤维细胞截留装置，其中，中空纤维细胞截留装置的结构为：包括由相互平行的4～10根中空纤维管组成的圆柱形套管，圆柱形套管底部依次设有弹性瓣膜、活塞和真空泵，圆柱形套管上部通过连接管与搅拌式生物反应器连接。本发明专利技术还公开了一种体外高密度培养红细胞的方法，包括以下步骤：（一）单个核细胞的分离；（二）CD34+造血干细胞分离；（三）造血干细胞分化成红细胞。使用本发明专利技术的装置和方法，可以使不同来源的造血干细胞在体外分化成大量功能完善的红细胞，可实现红细胞的高密度培养，比常规细胞培养方法提高200倍左右。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，属于再生医学领域。
技术介绍
目前，依靠人工献血的输血系统需要解决的五大问题是:1)血液需求不断增长；2)老龄化社会进程导致献血人口的不断下降；3)血液偏型，如稀有血型较难找到匹配者；4)疑难配血，如抗红细胞多重免疫等现象；5)输血安全问题。从造血干细胞中制造成熟的红细胞用于输血似乎为解决这个世界性的难题提供了一个可能的解决办法，法国巴黎第六大学Luc DOUAY教授领导的实验室已经从不同来源的造血干细胞(骨髓、外周血、胎肝、脐血)中成功在体外诱导出成熟红细胞，并且在小鼠实验中表明这些体外培养的红细胞能够发挥正常红细胞一样的功能，比如携带氧气。并且I期临床试验证明:把自体干细胞在体外扩增成熟的红细胞注入人体内，与人体内的红细胞在各项指标方面基本一致，包括膜弹性、血红蛋白含量以及红细胞体内携运输氧气功能等，完全可以替代人工献血来源的红细胞。尽管体外诱导生成红细胞为解决临床输血问题提供了一个有力的武器，但是真正实现工业化、规模化体外造血仍然面临着很多技术难题需要克服，其中一个重要的问题是体外高密度培养技术问题，因为一个单位红细胞含量约为2xl012个红细胞，如果按常规细胞培养密度(I 2X106cell/ml)，则培养每个单位红细胞需要的体积非常大(如果培养瓶平铺那么面积约为4个网球场面积大)，难以适应工业化生产需要，急切需要一种能够提高细胞培养密度、降低生产空间的装置和方法来适应规模化生产的需要。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种体外从造血干细胞高密度培养红细胞的装置和方法，通过该装置和方法培养的细胞密度比常规细胞培养方法提高200倍左右，大大降低了红细胞培养所用的体积，为真正实现红细胞工业化生产打下了坚实的基础。本专利技术是通过以下技术方案实现的:—种体外高密度培养红细胞的装置，包括搅拌式生物反应器和中空纤维细胞截留装置，其中，中空纤维细胞截留装置的结构为:包括由相互平行的4 10根中空纤维管组成的圆柱形套管，圆柱形套管底部依次设有弹性瓣膜、活塞和真空泵，圆柱形套管中部设有废液管，废液管末端设有废液袋，废液管上设有渗透泵，圆柱形套管上部通过连接管与搅拌式生物反应器连接，连接管上设有去白细胞滤网，连接管上连接有柔性管，柔性管末端设有柔性收集袋，柔性管上设有辐照装置。所述中空纤维管的内径为0.3mm,夕卜径为0.5mm,管壁上孔径为6 μ m。所述搅拌式生物反应器为现有技术中已有的产品，其结构为现有技术中常规的结构，如:包括搅拌罐，搅拌罐底部由水套包绕，水套底部有一进水口及出水口，搅拌罐上部设有容器盖，容器盖上设有DO (溶解氧值)监测装置、pH值监测装置、温度监测装置、液面感应装置、转子、气体入口、液体入口和液体出口，液体入口处连接有输送管，输送管上设有喂料泵，液面感应装置与喂料泵连接；液体出口通过连接管与圆柱形套管上部连接。所述体外高密度培养红细胞的装置的工作原理为:弹性瓣膜与活塞连接，可在真空泵作用下上下运动:当真空泵排出气体时，产生真空状态，从而让活塞带动弹性瓣膜向下运动，进而使得搅拌罐中的红细胞培养液通过连接管进入圆柱形套管；真空泵产生气体时，通过活塞推动弹性瓣膜向上运动，从而使得圆柱形套管中的红细胞培养液通过连接管进入搅拌罐；活塞带动弹性瓣膜上下运动使得红细胞培养液反复通过中空纤维管组成的圆柱形套管，废液不断通过废液管排出至废液袋，而培养的红细胞被截流在中空纤维管中从而实现了细胞的高密度培养(可以达到5 X IO7个细胞/ml至4X IO8个细胞/ml )。红细胞培养成熟后,通过去白细胞滤网可将白细胞去除,从而使得纯化后的成熟红细胞通过柔性管,红细胞中含有的部分有核细胞经过辐照后与脱核细胞一起被收集于柔性收集袋中。渗透泵将通过中空纤维管的废液排出，由废液袋收集。搅拌罐中的红细胞培养液由液体入口流入，当搅拌罐中的液面下降到一定程度后，液面感应装置感应到后，喂料泵自动启动将红细胞培养液输入搅拌罐内。一种体外高密度培养成熟红细胞的方法，包括以下步骤:(一)单个核细胞(MNC)的分离:(I)将血样置于50ml离心管中，离心2000rpm，IOmin ；所述血样可以购买得到，也可以自行采集；以脐带血为例，自行采集时，按照脐带血标本采集标准进行采集，足月或早产分娩，排除传染性疾病及各种家族遗传疾病，标本采集严格无菌操作；使用复方枸橼酸血液保护液抗凝；脐血平均容积为50 100ml，标本在采集后的3h内进行分离。所述造血干细胞血样的来源可以是骨髓、外周血、脐带血以及12 24周胎儿肝脏。 (2)吸取上层血浆转入另一根50ml离心管中，离心2000rpm，lOmin，吸取上层澄清的血浆，56°C灭活30min，可用于自体灭活血浆在培养过程的前6天的添加应用；(3)用生理盐水将上述除去血浆后的血样标本还原至原始体积，混匀，得稀释血样;(4)将室温的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque (密度1.077)加入50ml无菌离心管中，15ml/管；(5)将30ml稀释血样缓慢加在上述15ml的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上，将离心机温度设置为室温，加速度为最低，减速过程设定为brake off (无闸减速)后,离心2000rpm，离心20min，离心管中间白膜层为单个核细胞层；所述步骤(5)的具体操作方法为:将离心管倾斜45°，在淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque液面以上Icm处缓慢加入稀释血样,注意不要打乱液面界面。(6)将平口巴氏滴管轻轻插入到单个核细胞层上2mm处，沿着管壁小心地准确吸取该层细胞并转移到另一支新的50ml离心管中，每管加生理盐水至50ml，轻轻吹匀细胞，离心洗洚2次(第I次,室温1500r/min, 5min ;第2次,室温1300r/min, 7min),以除去血小板和分离介质，即得到单个核细胞；(二)⑶34+造血 干细胞分离(免疫磁珠分离法):(I)向上述分离的单个核细胞加入5mlPBS缓冲液(Gibico公司)，离心1500r，3分钟，去上清；(2)每IO8个单个核细胞加入100 μ I FcR封闭剂(Miltenyi公司)，再加入100 μ I磁珠偶联CD34+抗体(Miltenyi公司)，混匀，在4°C条件下放置15分钟后加入HmlPBS缓冲液，1500r、4°C下离心3分钟，去上清；(3)上述离心后得到的沉淀重新用500 μ IPBS缓冲液悬浮；(4)将分离柱固定于磁铁上，用500 μ IPBS缓冲液清洗分离柱； (5)将步骤(3)中的液体样本通过分离柱，然后用PBS缓冲液润洗分离柱3次以去除非特异性结合的细胞；(6)取下分离柱，用ImlPBSS缓冲液或HAS液冲洗分离柱，收集⑶34+细胞于离心管中；(三)造血干细胞分化成红细胞:(I)⑶34+细胞铺瓶培养，收集到的⑶34+细胞以5xl04/ml铺瓶，培养液为Pl培养液，Pl培养液时以IMDM培养基(GIBIC0公司)为基础培养基配制的，培养液中含EPCKsigma公司，3 6U/ml)，INSULIN (sigma 公司，50 100ng/ml)，SCF (R&D 公司，50 IOOng/ml),DEX (Sigma 公司，5 10 μ M), I本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种体外高密度培养红细胞的装置，其特征在于：包括搅拌式生物反应器和中空纤维细胞截留装置，其中，中空纤维细胞截留装置的结构为：包括由相互平行的4～10根中空纤维管组成的圆柱形套管，圆柱形套管底部依次设有弹性瓣膜、活塞和真空泵，圆柱形套管中部设有废液管，废液管末端设有废液袋，废液管上设有渗透泵，圆柱形套管上部通过连接管与搅拌式生物反应器连接，连接管上设有去白细胞滤网，连接管上连接有柔性管，柔性管末端设有柔性收集袋，柔性管上设有辐照装置。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶永清，
申请(专利权)人：叶永清，
类型：发明
国别省市：
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