本发明专利技术公开了一种用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原及其制备的抗体和应用。本发明专利技术提供了用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原，是将含有变性Bt蛋白的溶液和佐剂混合并乳化得到的产物。所述免疫原免疫动物得到的多克隆抗体也属于本发明专利技术的保护范围。所述多克隆抗体可用作包被抗原和/或检测用一抗，从而用于检测待测样本中是否含有变性Bt蛋白。所述待测样本可为煮熟的转基因作物，转基因作物加工得到的食品或饲料等。本发明专利技术对转基因粮食作物的生物安全性评价具有实用价值，潜在社会效益巨大。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原及其制备的抗体和应用。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白(又称Bt杀虫晶体蛋白或Bt蛋白)具有抗虫作用，因此其编码基因(Bt基因)在转基因棉花等作物上应用广泛。根据编码基因序列的同源性和编码蛋白的杀虫谱，Bt蛋白分为cry族和cryt族，每一族下又分为数量不等的亚类。目前在植物中表达的Bt基因有CrylAa基因、CrylAb基因、CrylAc基因、Cry2Aa基因、Cry3Bb基因和Cry9c等基因。中国市场上商业化的转Bt基因作物中主要转入了针对鳞翅目昆虫幼虫有毒性的CrylAc基因。用转基因棉花籽粒生产棉籽油后，可以得到副产物棉籽饼，棉籽饼通常用作家禽或家畜的饲料。棉籽饼中，常常残留有变性Bt蛋白，对家禽或家畜具有潜在的危害，从而可能对食用家禽或家畜的人类造成潜在的危害。应用目前国内外商业化的免疫检测试剂盒或试纸条，基本检测不到棉籽饼中的变性Bt蛋白，迫切需要能够识别变性Bt蛋白的抗体以及方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原及其制备的抗体和应用。本专利技术提供了用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原，是将含有变性Bt蛋白的溶液和佐剂混合并乳化得到的产物。所述含有变性Bt蛋白的溶液的制备方法可如下:用蛋白变性剂处理含有Bt蛋白的溶液，得到含有变性Bt蛋白的溶液。所述变性剂可为β-巯基乙醇和/或SDS (十二烷基横酸纳)。所述含有变性Bt蛋白的溶液的制备方法可如下:将含有Bt蛋白的溶液和溶液丙混合后进行变性处理，得到含有变性Bt蛋白的溶液；所述含有Bt蛋白的溶液和所述溶液丙的体积配比为1:(1-10);所述溶液丙由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度如下:体积比为0.1-2%的β -巯基乙醇和0.1-10.0mg/1OOmL的SDS。所述变性处理可为在40-100°C水中水浴。所述变性处理可为在100°C沸水中水浴3-5分钟。所述变性处理可为在-20°C冰箱反复冻融3次以上。所述变性处理可为调pH至3以下或调pH至10以上。所述调PH至3以下具体是通过加入硫酸水溶液的形式实现的。所述硫酸水溶液具体可为IM硫酸水溶液。所述调pH至10以上具体是通过加入氢氧化钠水溶液的形式实现的。所述氢氧化钠水溶液具体可为IM氢氧化钠水溶液。所述含有变性Bt蛋白的溶液的制备方法可如下:将含有Bt蛋白的溶液进行变性处理，得到含有变性Bt蛋白的溶液。所述变性处理可为在40-100°C沸水中水浴。所述变性处理可为在100°C沸水中水浴3-5分钟。所述变性处理可为在-20°C冰箱反复冻融3次以上。所述变性处理可为调PH至3以下或调pH至10以上。所述调pH至3以下具体是通过加入硫酸水溶液的形式实现的。所述硫酸水溶液具体可为IM硫酸水溶液。所述调pH至10以上具体是通过加入氢氧化钠水溶液的形式实现的。所述氢氧化钠水溶液具体可为IM氢氧化钠水溶液。所述Bt蛋白可以为苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体、原核表达的Bt蛋白、转基因作物中提取纯化的Bt蛋白或者商购的Bt蛋白。以上任一所述含有Bt蛋白的溶液具体可为蛋白浓度为0.1-lmg/mL的Bt蛋白溶液。可用ρΗ7.5、0.lmol/L的PB缓冲液调整蛋白浓度。所述Bt蛋白具体可采用如下方法制备:(I)将抗虫棉种 子去壳后进行可溶性总蛋白的提取，得到溶液甲；(2)将所述溶液甲进行60%饱和度的硫酸铵沉淀，离心收集沉淀；(3)溶解步骤(2)得到的沉淀并进行透析，得到溶液乙；(4)将所述溶液乙进行免疫亲和层析，收集与抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体特异结合的蛋白组分，即为Bt毒蛋白；所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体为是由杂交瘤Bt2F9CGMCC N0.5162分泌产生的单克隆抗体。杂交瘤Bt2F9为稳定分泌抗转基因植物中Bt CrylAb/Ac蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为 CGMCC N0.5162。所述步骤(I)中，可采用ρΗΙΟ.5、0.0lM的CAPS缓冲液提取所述可溶性总蛋白。所述步骤(I)中，所述溶液甲的制备方法具体如下:将所述抗虫棉种子去壳并研磨成粉，然后用PH10.5、0.0lM的CAPS缓冲液提取(提取温度具体可为4°C，提取时间具体可为4小时；提取过程中可用磁力搅拌器搅拌，以增加提取效率)，离心(离心条件具体可为:40C UOOOOrpm离心20分钟)后避开表层油脂取上部液体，即为所述溶液甲。所述步骤(2)中，所述“进行60%饱和度的硫酸铵沉淀”的实现方法如下:在所述溶液甲中加入硫酸铵并使其达到60%饱和度，然后冰浴放置。所述冰浴放置的时间具体可为40分钟。所述冰浴放置过程中可用磁力搅拌器搅拌。所述离心的参数具体可为:4°C、7000rpm离心20分钟。所述步骤(3)中，可用去离子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液调pH至10.5。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为:用PBS缓冲液4°C透析6小时(每两个小时更换新的PBS缓冲液)。所述步骤(4)中，所述免疫亲和层析的步骤可如下:①将所述溶液乙上样于连接有所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体的免疫层析柱；②用清洗液清洗柱子，去除杂蛋白用洗脱液进行洗脱，收集过柱后洗脱液，即为含有目的蛋白的溶液。所述免疫亲和层析的填充料可为CNBr-activated Sepharose4B。所述清洗液具体可为pH2.5、0.0lM的Gly-HCl缓冲液。所述洗脱液具体可为含体积比为50%的乙二醇的pH2.5,0.0lM的Gly-HCl缓冲液。所述免疫亲和层析过程中，具体可采用4转/分的上样流速、清洗流速和洗脱流速。所述步骤②中具体可用2倍上样体积的清洗液清洗柱子。所述步骤③中具体可用3倍体积的洗脱液进行洗脱。所述步骤③中具体可按Iml每管收集过柱后的洗脱液。所述方法中还可包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5的步骤。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述方法中还可包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5然后进行透析的步骤。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为:用PBS缓冲液4°C透析6小时(每两个小时更换新的PBS缓冲液)。 所述方法中还可包括 将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5，然后检测其中是否含有Bt毒蛋白，最后将含有Bt毒蛋白的溶液进行透析的步骤。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为:用PBS缓冲液4°C透析6小时(每两个小时更换新的PBS缓冲液)。所述“检测其中是否含有Bt毒蛋白”的具体方法如下:( i )用抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆包被酶标板；(幻在步骤(i)的酶标板中加入调pH至7.5后的过柱后洗本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原，是将含有变性Bt蛋白的溶液和佐剂混合并乳化得到的产物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王保民，曹振，张亮，张威，张瑞，谭桂玉，南铁贵，崔永亮，郭素琴，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。