异丹叶大黄素在制备抗肿瘤活性药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种异丹叶大黄素在制备抗肿瘤活性药物中的应用，所述应用通过下调X连锁凋亡抑制蛋白基因表达来抑制X连锁凋亡抑制蛋白活性；本发明专利技术利用蛋白免疫印迹、RT-PCR、ATP生物荧光检测法、CHIP等方法证实，ISO预处理多种肿瘤细胞均可显著抑制XIAP基因表达水平，并进而诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖；ISO并不能显著诱导肿瘤细胞增殖和凋亡，证实内源性XIAP基因是ISO治疗的有效靶标，特异性抑制XIAP的基因表达，并通过实验证实ISO可有效地提高化疗药物的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，将在基础医学、临床治疗与新药研发等方面具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种中药单体异丹叶大黄素(ISO)在制备抗肿瘤活性药物中的应用即，异丹叶大黄素在肿瘤细胞中抑制X连锁凋亡抑制蛋白活性中的应用。
技术介绍
目前恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病，其中肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、膀胱癌的发病率和死亡率一直显著上升。具有早期易转移、晚期难治、预后差、易产生耐药等特点，而传统的手术、化、放疗的疗效不尽人意。传统的治疗方法的局限性决定了生物治疗必然要参与恶性肿瘤的综合治疗，并有可能在其中发挥至关重要的作用，而基因治疗是肿瘤生物治疗的重要方法之一。大量研究证明，X连锁凋亡抑制蛋白(x-linked inhibitor ofapoptosis protein, XIAP)作为一种多功能生物分子，参与多种受体介导的信号转导，在肿瘤的发生和发展中起着重要作用，既可作为一个较普遍的标志物用于肿瘤的早期诊断，又可作为判断肿瘤预后的重要标志物。高表达XIAP的肿瘤均具有早期易转移、晚期难治、预后差等特点，传统的手术、化疗、放疗的疗效均不尽人意。XIAP在肿瘤化疗敏感性中的作用及价值受到国内外学者广泛关注。现已明确，肿瘤细胞中XIAP水平的升高是肿瘤细胞逃避化疗药物杀伤作用的原因之一。在多种肿瘤中，如在胃癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌等细胞系中，均证实通过下调XIAP蛋白水平，可提高肿瘤对化疗药物的敏感性。XIAP可通过多种途径抑制细胞凋亡，以其作为肿瘤治疗靶点的研究已经从实验室进入了临床研究阶段。目前临床治疗多用XIAP表达的干扰剂，如采用反义寡核苷酸为基础的基因治疗、XIAP小分子抑制剂等，但受到诸多因素的限制，包括药物稳定性差、需要多次重复给药、细胞膜通透性差、转染效率不稳定等。尽管采用了一些辅助如脂质体包裹、纳米粒的形式，但临床上使用仍然受到非常大的限制，尤其是患者安全性方面的限制。因此能否从中国的中药宝库中筛选出一种中药单体，可特异性抑制XIAP的基因表达，将在基础医学、临床治疗与新药研发等方面具有广阔的应用前景。专利技术人通过筛选的方法,鉴定出从小叶买麻藤植物(Gnetum parvifolium)中分离得到多种中药单体中异丹叶大黄素(Isorhapontigenin, ISO),可有效抑制细胞内XIAP基因表达有效地抑制XIAP基因的表达，提高肿瘤治疗有效率、降低肿瘤耐药率。ISO单体(Huang KS, Zhou S，Lin M, Wang YH.An isorhapontigenin tetramer and a novelstilbene dimer from Gnetum hainanense.Planta Med.2002,68 (10): 916-20.),化学结构式:3，5，4-三羟基-3'-甲氧基反式二苯乙烯，分子式=C15H14O4，化合物分子量258.2道尔顿。该单体与肿瘤的关系还鲜有报道。《中华本草》记载，买麻藤归肺经、膀胱经。中国传统医学将买麻藤用来祛风去湿、活血散瘀，可以用来治疗关节炎、支气管炎、胰腺炎、膀胱炎、心血管系统疾病等。最新的研究文献证实，ISO可以抑制包括PKC、MAPK以及PI3K-Akt-p70S6K/GSK3b信号途径，通过这些信号途径进而直接或间接地阻断NF-B和AP-1的活性。这些信号途径在肿瘤细胞的发生、发展中也起着极为重要的作用。ISO预处理包括膀胱癌、结肠癌等肿瘤细胞后，应用Western-Blotting和RT-PCR法，分析检测证实XIAP蛋白和mRNA水平均在治疗后显著下降。ISO可抑制膀胱癌细胞增殖，并可通过下调XIAP基因表达，显著增强多西他赛诱导的膀胱癌细胞凋亡，并增强细胞毒性。相关内容尚未见有关报道。
技术实现思路
本专利技术目的是提供异丹叶大黄素可选择性下调肿瘤药物治疗靶标-XIAP蛋白的应用，即提供异丹叶大黄素在制备抑制X连锁凋亡抑制蛋白活性药物中的应用，将在基础医学、临床治疗与新药研发等方面具有广阔的应用前景。本专利技术采用的技术方案是:本专利技术提供一种异丹叶大黄素(ISO)在制备抗肿瘤活性药物中的应用，所述应用通过下调X连锁凋亡抑制蛋白基因表达来抑制X连锁凋亡抑制蛋白活性，即所述异丹叶大黄素通过抑制肿瘤细胞内X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达来抑制肿瘤细胞增殖。进一步，所述X连锁凋亡抑制蛋白为肿瘤细胞内的内源性蛋白，具体为异丹叶大黄素通过下调肿瘤细胞内的内源性XIAP基因表达来诱导肿瘤细胞凋亡。所述肿瘤细胞为膀胱癌T24T细胞、膀胱癌RT112细胞、膀胱癌UMUC3细胞或大肠癌HCT116细胞。进一步，所述异丹叶大黄素(ISO)在制备抗肿瘤活性药物中的浓度为20 60 μ mol/Lo本专利技术所述 ISO下调肿瘤细胞内XIAP基因表达来诱导肿瘤细胞凋亡的鉴定方法为:首先通过Western-Blotting和RT-PCR法，分析检测证实肿瘤细胞内的XIAP mRNA和蛋白水平均在治疗后显著下降。通过转录XIAP-启动子荧光素酶报告基因，发现ISO可显著地下调启动子荧光素酶报告基因的活性。接着利用染色质免疫沉淀(CHIP)的方法，证实ISO可以通过抑制转染因子SPl与XIAP启动子的结合从而抑制XIAP基因的转录。因此，ISO通过下调XIAP基因水平显著抑制肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡。本专利技术所述利用ISO抑制XIAP活性水平来进行肿瘤基因治疗的方法可应用于多种肿瘤细胞内，比如膀胱癌、结肠癌。进一步证实，ISO可抑制膀胱癌细胞增殖，并可通过下调XIAP基因表达，显著增强多西他赛诱导的膀胱癌细胞凋亡，并增强细胞毒性。本专利技术所述利用ISO抑制XIAP活性水平来治疗恶性肿瘤的药物作用机制为:XIAP是一种多功能生物分子，参与多种受体介导的信号转导，在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。高表达XIAP的肿瘤具有早期易转移、晚期难治、预后差等特点，易耐药等特点。通过下调XIAP蛋白水平，可明显提高消化道肿瘤对化疗药物的敏感性，成为重要的生物治疗靶点之一 O本专利技术的有益效果主要体现在:本专利技术利用蛋白免疫印迹、RT-PCR、ATP生物荧光检测法、CHIP等方法证实:ISO预处理多种肿瘤细胞均可显著抑制XIAP基因表达水平，并进而诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖；以肠癌HCTl 16细胞为模型，外源性XIAP基因转染到XIAP基因敲除型肠癌HCTl 16细胞，ISO并不能显著诱导肿瘤细胞增殖和凋亡，证实内源性XIAP基因是ISO治疗的有效靶标，特异性抑制XIAP的基因表达，并通过实验证实ISO可有效地提高化疗药物的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，将在基础医学、临床治疗与新药研发等方面具有广阔的应用前景。附图说明图1为ISO可抑制膀胱癌T24T细胞增殖诱导细胞凋亡:不同浓度(0、20、40、60、80 μ mol/L)的ISO溶液诱导膀胱癌T24T细胞24h后的相差显微镜图。图2为ISO可诱导膀胱癌T24T细胞凋亡:不同浓度(0、20、40、60、80 μ mol/L)的ISO溶液诱导膀胱癌T24T细胞24h后的流式细胞仪检测图谱。图3为ISO诱导膀胱癌T24T细胞PARP蛋白和Caspase-3蛋白裂解的Western-Blot图，以20 60 μ mol/L ISO溶液与膀胱癌T24T细胞作用24h后，Western-blotti本文档来自技高网...

【技术保护点】
异丹叶大黄素在制备抗肿瘤活性药物中的应用，其特征在于所述应用通过下调X连锁凋亡抑制蛋白基因表达来抑制X连锁凋亡抑制蛋白活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：方勇，候琦，潘宏铭，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：