微生物的捕获制造技术

通过在固体表面的存在下向液体中加入足量的水溶性聚合物以使微生物和/或片段从液体转移至所述固体表面而将存在于水性液体中的所述微生物、包括真菌、病毒和细菌例如分枝杆菌和/或微生物片段、例如细胞壁组分捕获至固体表面。可通过珠子提供所述表面。所述水溶性聚合物可以是聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】微生物的捕获本专利技术涉及从悬浮物中捕获微生物的方法，以及其随后的检测和/或鉴定。背景在许多应用中希望从其悬浮物中捕获微生物，这作为第一个步骤而允许随后对所述微生物进行其它工作，例如将微生物浓缩为不含杂质和污染物的小体积，用于例如诊断目的。所述微生物可起初存在于大体积样品材料中，例如痰，血液，分散的食物或饮用水中。浓缩为不含样品污染物的小体积在诊断程序中会优化灵敏度并去除抑制物，所述诊断程序是例如显微镜检查，免疫测定或核酸扩增程序，例如PCR。现存的用于实现微生物浓缩的方法包括使用涂覆了微生物特异性抗体的顺磁珠子；所述珠子可被用于从样品中特异性地捕获微生物，从而允许通过各种方法对其进行随后的检测(US7166425)。然而，在一些应用中，捕获条件可能不适于基于抗体的系统:例如，在从痰中捕获分枝杆菌时，所述痰已用氢氧化钠稀释并且保持为高PH，这将使抗体失活。在这些以及其它严苛条件的情形中，不能使用抗体捕获。此外，在其它应用中可能需要捕获可能存在于样品中的任何微生物。例如，在败血症中，重要的是捕获可能存在于血液中的任何细菌或真菌细胞从而可进行诊断。类似地，在测试血液产品时(例如在血小板筛选中)，重要的是了解所述血液产品(在此情形中是血小板)究竟是否被任何微生物污染。在这种情形中，用基于抗体的方法将难以进行这些，因为抗体倾向于是生物体或物种特异性的。曾描述过不是基于抗体的方法。JP2001112497描述了通过沉淀其中的磷酸钙而从碱净化的液体中去除分枝杆菌的方法，推测沉淀物在形成时带下细菌。W02009/086343描述了将碳水化合物涂覆的表面与生物素结合蛋白以及类固醇或三萜的两亲性糖苷一起使用以结合微生物。W028072242A2描述了以氨基酸衍生的聚合物基质作为结合表面，且W029046191A2描述了使用以各种金属或无机表面涂覆的硅藻土颗粒来实现相同的结果。这些方法比基于抗体的方法更为通用但是不是真正通用的，因为某些细菌种类比其它种类更好地被捕获，且某些细菌种类或菌株可能根本不被捕获。此外，没有显示这些方法用于捕获真菌。这些问题是依赖于结合基质的表面特性(其在性质上必然受限)来结合可具有多样的外细胞壁结构的细菌的结果。在本专利技术中，我们描述了新的方法，其较少依赖于表面基质的性质并且被显示出除对分枝杆菌(倾向于具有独特的疏水性细胞壁)起作用外，也对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌起作用。专利技术简述我们现在发现了有可能使用水溶性聚合物来引起悬浮的微生物沉积在固体表面上。此方法还起作用以引起微生物的可沉淀和不可沉淀的片段沉积在固体表面上。虽然已经得知通过加入水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)或右旋糖苷而不涉及固体表面可引起溶液中的蛋白沉淀有一段时间了，但是关于微生物及其片段的这些发现是出人预料的。W095/32304使用水性两相聚合物分离系统来选择性提高靶微生物相对于背景菌群的数目，但是没有暗示捕获至固体表面。因此，本专利技术现在提供了将水性液体中的微生物和/或其片段捕获至固体表面上的方法，所述方法包括在固体表面的存在下向所述液体中加入足量的水溶性聚合物以将所述微生物和/或片段从所述液体转移至所述固体表面。或者表述为，所述方法可包括将固体表面与含有微生物和/或其片段的水性液体及水溶性聚合物一同提供，以将所述微生物和/或其片段从所述液体转移至所述固体表面上。可以此方式被捕获的微生物片段包括可沉淀的片段，可利用以4，OOOx g离心20min来离心所述片段而从液体中沉积，其中4，OOOx g是通常用于沉淀细菌的速度。令人惊讶地，所述方法也起作用以捕获片段，所述片段可包括在这种离心条件下不能被引起沉积并且可被称为不可沉淀的可溶性蛋白或其它可溶性细胞组分。可根据聚合物的性质自由调节水性液体中所添加的水溶性聚合物的浓度，从而产生所希望的将微生物和/或片段从待沉积液体中的悬浮物或溶液中转移至固体表面上。任选地，所述聚合物浓度为2至30%w/v,优选5至20%w/v,更优选7至15%w/v,最优选约10%w/ν.这些浓度特别适于与以PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(作为所述聚合物)一起使用。优选地，所述水溶性聚合物是非离子亲水性聚合物。其例如可以是右旋糖苷，PVP或PEG。所述PEG可以是在分子量方面多分散的或者是单分散的，可以是分支的或直链的并且可以是星型的。适当地，所述水溶性聚合物具有的重均分子量为200至100，000。其可例如具有下列分子量1，000至20，000，更优选5，000至13，000，例如约8000。这些分子量特别适于PEG或PVP的情形。可通过使用高离子强度条件来提高微生物与固体表面的结合。适当地，通过加入水溶性无机盐而将所述水性液体的离子强度提高到150mM至6M，更优选0.25至0.75M，例如 0.5M。可向所述溶液中加入许多不同的盐以实现高离子强度，例如硫酸铵，氯化铵，硫酸镁，氯化镁，但是氯化钠是优选的。可在1-14范围中的高或低pH条件下进行与表面的结合。当所述微生物是分枝杆菌时，高pH、例如9至14可以是优选的，以消灭或降低繁殖可能存在的其它种类的细菌的能力。此外，可在去污剂的存在下进行与表面的结合，所述去污剂可包括离子性(例如十二烷基硫酸钠)或非离子性(例如Tween20和Triton X100)去污剂。优选的是，所述固体表面具有高的比表面积，因而优选通过珠子提供所述固体表面。术语“珠子”包括但不限于下述不可溶颗粒:其性质为球形的或不规则的，大小为0.1微米至5mm。根据本专利技术的方法还可包括从所述液体中分离所述固体表面。对于微生物的一般性浓缩有完善的物理方法，例如:过滤样品，其中细胞被俘获在尺寸排阻滤器的表面上或深度滤器的结构内；或者离心，其中细胞被沉淀。虽然这些方法可用于制备不含样品污染物的微生物浓缩悬浮物，它们也有缺点。在过滤方法中，捕获确定大小的完整生物体是简单的(受制于过滤的内在缺点)，但是以这种方式来捕获不确定大小的生物体片段是更加困难的。此外，在通过过滤器俘获了微生物之后可能难以回收它们，并且当通过洗脱或逆流清洗过程进行回收时，所述微生物可能不利地存在于相对大的流体体积中。再一次地，离心可被用于浓缩完整的生物体但是在所使用的速度和时间下微生物的片段可能是不可沉淀的。此外，离心需要设备并且此步骤也不能被容易地并入微生物浓度和检测的自动化程序中。此外，在离心之后，以所希望的小体积可靠地重悬含有微生物的经沉淀的沉淀物是困难的，通常需要更大的体积来确保完全分散管中的沉淀物。因此，优选的是，在其上接受微生物和/或片段的固体表面的性质使得不使用过滤或离心而能将所述固体表面从悬浮液体分离。因此优选的是，所述珠子可被吸引至磁体以进行分离或者其足够致密从而即使含有聚合物的液体十分粘稠也可通过沉淀被分离。因此，优选的是所述珠子是顺磁的或者具有充分高于所述液体密度的密度从而它们在不离心时发生沉淀，例如高于2.0g/ml，更优选高于3.0g/ml。备选地，它们可具有充分低于所述液体密度的密度从而它们将分离以浮在所述液体上，例如空心珠，其可以是玻璃的。此类有浮力的珠子可具有低于0.8g/ml的密度,例如0.4至0.7mg/mL.合适的致密珠子材料，或珠核心材料是氧化铝，碳化硅，氮化硅，碳化钛，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·J·斯坦利，S·M·威尔森，
申请(专利权)人：米克罗森斯医疗技术有限公司，
类型：
国别省市：