本发明专利技术提供了脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria?meningitidis)PorA构建体，其一个或更多个可变区通过插入完整保守区或保守区氨基酸而被破坏。PorA的高免疫原性可变区是引发不具有广泛保护性的菌株特异性免疫应答的原因，所以破坏可变区使得免疫应答针对保守区表位，从而针对更广谱的脑膜炎奈瑟氏菌菌株提供有效免疫。本发明专利技术还提供了编码核酸、基因构建体、表达PorA构建体的宿主细胞，以及用于检测和治疗脑膜炎奈瑟氏菌感染的组合物、试剂盒和方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及构成修饰形式的脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)PorA蛋白的新蛋白质，编码这些蛋白质的核酸，及其在治疗性和预防性方法中的用途、组合物、特别是疫苗。更特别地，通过破坏PorA表面环中的非保守氨基酸，本专利技术提供了可用于疫苗的蛋白质和编码核酸，与相应的野生型PorA蛋白的预期结果相比，所述疫苗针对更广谱的脑膜炎奈瑟氏菌菌株提供有效免疫。
技术介绍
脑膜炎奈瑟氏菌是革兰氏阴性菌，是流行性脑脊髓膜炎和败血症的病原体。其已知的唯一宿主是人，约10 %的人群可无症状地携带它(Caugant等，1994, J.Clin.Microbiol.32323)。脑膜炎奈瑟氏菌可表达多糖荚膜，而这允许其根据所表达荚膜的性质对该细菌进行分类。脑膜炎奈瑟氏菌有至少十二个血清组:A、B、C、29-E、H、1、K、L、W135、X、Y和Z，其中血清组A、B和C引起90 %的脑膜炎球菌病(Poolman等，1995, Infect.Agents andDis.413)。有针对血清组A和C的疫苗可用，但是血清组B荚膜多糖的免疫原性不佳，在人中不诱导保护。 因此正在检查另一些膜组分和胞外组分是否适合包含在疫苗中。实例包括1、2和3类外膜蛋白(孔蛋白(porin) ; Spor基因编码)和4类外膜蛋白(Rmp)和5类外膜蛋白(Opacity蛋白；由opa和opc基因编码)。但是,脑膜炎奈瑟氏菌通过抗原性和相变异而非常有效地逃避免疫应答。例如，Opc蛋白是具有高度免疫原性(Wiertz等，1996，InfectImmun.64298-304)的粘附素 / 侵袭素(Vir ji 等，1995，Mol Microbiol.18741-54)，但是其表达是可相变的(phase-variable) (Sarkari 等，1994, Mol Microbiol.13207-17),并且通过转换(diversion)产生针对高免疫原性移动靶标(特别是PorA)的免疫应答。PorA在菌株之间高度可变并且在患者和无症状携带者中均产生免疫应答，其程度使得它已作为代表血清亚型系统的用于菌株鉴定的标志物(McGuinness等，1990，J ExpMed.1711871-82)。PorA是关键抗原，其已用于先前有效且已注册的疫苗制剂中，并且被认为是引发有效杀菌抗体的理想抗原。但是，表面环在菌株之间的可变性使得靶标可变，并且疫苗通常是PorA类型特异性的。虽然已做出了许多努力以产生覆盖多至六种不同PorA类型的多价 PorA 疫苗(van der Voort 等，1996, Infect Immun.642745-51),但是该祀标已被断定为可变性过高，因此最近的疫苗开发基本抛弃了这种抗原。PorA单体拓扑学的现有模型显示出八个胞外环(Derrick等，1999, Infect.Tmmun.672406-13 ；van der Ley 等，1991, Infect.Tmmun.592963)。最长的环(I 和 4)可变性最高，因此称为可变区I (VRl)和可变区2 (VR2)。环5和6中看到的可变性较低(分别为半可变区SVRl和2)，其余的环中基本上没有可变性。预计环3在由PorA三聚体的每一个亚基形成的孔中形成“塞(Plug)”。即使在VRl和VR2内，大部分可变性只限于预测形成每个环尖端的残基。实际上，在小鼠和经免疫的人志愿者中，表位作图都表明大多数抗体应答针对环I和4的“顶端”-菌株之间可变的区域(van der Voort等，1997, FEMS Immunol.Med.Microbiol.17139-48),推测这解释了抗PorA应答的菌株特异性。
技术实现思路
本专利技术人认识到，PorA的高免疫原性表面环是引发不具广泛保护性的菌株特异性免疫应答的原因，使得掺入来源于特定脑膜炎奈瑟氏菌菌株的PorA蛋白的疫苗倾向于优先针对该特定菌株提供免疫。因此，本专利技术人试图生产这样的PorA蛋白:其引发的免疫应答的菌株特异性不像野生型PorA引发的免疫应答那样高。与用野生型PorA免疫后的预期结果相比，通过使免疫应答主要针对保守性表位，包含所述分离蛋白质的疫苗应针对更广谱的脑膜炎奈瑟氏菌菌株提供免疫。在第一方面中，本专利技术提供了包含脑膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白之氨基酸序列的分离蛋白质，其中所述PorA蛋白的可变区中的一个或更多个氨基酸被破坏。合适地，所述PorA蛋白可变区中的一个或更多个氨基酸通过包含一个或更多个PorA保守区或保守区氨基酸而被破坏(例如，与野生型PorA相比)。优选地，所述保守区是保守环2、保守环3、保守环7和/或保守环8的氨基酸序列，或者包含以上氨基酸序列。合适地，所述可变区选自VR1、VR2、SVR1和SVR2区。 优选地，所述可变区选自VRl和VR2区。所述可变区和所述保守区可以是、衍生自或来源于相同或不同的PorA蛋白。合适地，本专利技术的分离蛋白质能够引发免疫应答。优选地，所述免疫应答 的菌株特异性低于由相应的野生型PorA蛋白引发的免疫应答。更优选地，所述免疫应答提供了针对一种或更多种脑膜炎奈瑟氏菌菌株(或者甚至更优选地针对多种脑膜炎奈瑟氏菌菌株)的保护。本专利技术提供了本方面分离蛋白质的一些具体实施方案。图1和2提供了本方面分离蛋白质的一些具体实例(SEQ ID NO:11-22)。优选地，所述分离蛋白质包含SEQ ID NO:11-22中任一个所示的氨基酸序列。优选地，所述分离蛋白质中被破坏的可变区不由VRl和/或VR2区的缺失组成(例如 SEQ ID NO:2-4 所述)。根据第一方面，本专利技术包括本专利技术分离蛋白质的同源物、片段、变体和衍生物。在该方面的一个具体实施方案中，所述分离蛋白质存在于外膜蛋白囊泡(OuterMembrane Protein Vesicle, OMV)中。在第二方面中，本专利技术提供了编码根据第一方面的多肽的分离核酸。图2中提供了本方面分离核酸的一些具体实例(SEQ ID NO:23_43)。优选地，所述分离核酸包括SEQ ID NO:32-43中任一个所述的核苷酸序列。根据第二方面，本专利技术包括本专利技术分离核酸的同源物、片段、变体和衍生物。在第三方面中，本专利技术提供了包含根据第二方面的分离核酸和一种或更多种其他核苷酸序列的基因构建体。在一种优选形式中，所述基因构建体是包含表达载体和根据第二方面的分离核酸的表达构建体，其中所述分离核酸与所述表达载体中的一种或更多种调节核酸有效连接。在第四方面中，本专利技术提供了包含根据第三方面的基因构建体的宿主细胞。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是包含染色体整合的表达构建体的细菌。优选地，所述细菌是脑膜炎奈瑟氏菌。在本专利技术的第五方面中，提供了一种产生根据第一方面的重组分离蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤:(i)培养包含根据第三方面的表达载体的宿主细胞，以使所述多肽在所述宿主细胞中表达；以及(ii)分离所述重组多肽。在第六方面中， 本专利技术提供了与本专利技术的分离蛋白质、其片段、变体或衍生物结合或者针对它们而产生的抗体或抗体片段。在第七方面中，本专利技术提供了一种检测脑膜炎奈瑟氏菌细菌的方法，所述方法包括以下步骤:_(i)使第六方面的抗体或抗体片段与得自哺乳动物的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·保罗·詹宁斯，伊恩·理查德·安塞尔姆·皮克，
申请(专利权)人：格里菲斯大学，
类型：
国别省市：
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