本发明专利技术属于核酸诊断技术领域,具体为一种同步提取并荧光互补探针杂交同步检测肝炎和艾滋病毒的方法及试剂盒。该方法包括以磁珠作为自动化介质,通过生物素及寡聚核苷酸修饰的捕获探针特异性同步捕获HBV、HCV、HIV-1核酸的方法和实时同步多项检测的基于Taqman探针的荧光互补探针杂交法。相应的试剂盒包括去抑制剂、裂解液、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液、内对照、2×Annealing?Buffer、荧光探针、阳性对照、阴性对照。本发明专利技术的特点是:无需PCR反应、单管操作、封闭性检测、自动化程度高、多种病毒核酸同步提取,同步实时检测;灵敏度高、特异性好、精密度高;适用于大规模血液筛查、临床检验及科研单位使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于诊断试剂一核酸诊断
,具体涉及一种灵敏度高、特异性强、适合于常规血液核酸筛查的同步提取和同步实时检测肝炎(包括乙型肝炎和丙型肝炎)和艾滋病毒核酸的方法和试剂盒。
技术介绍
据世界卫生组织(WHO)统计,超过一半国家没有对献血者献出的血液进行彻底检验,导致艾滋病、肝炎、疟疾和梅毒等疾病在很多地方泛滥。全球每年增加的560万名艾滋病毒携带者中,有5% 10%的人是经由输血或血液制品而感染的。在非洲儿童和妇女中病毒携带者的比例高达20% 25%。20世纪80年代以来,法国、日本、罗曼尼亚、美国、德国以及中国等国家都曾因血液筛查欠缺而导致过严重的后果。血液传染病一旦在一个地方发生,往往会造出爆炸性传播,因此输血安全对人民的安全和社会的稳定有着极其特殊的意义。临床血液检测也面临日益剧增的检测压力。据WHO估计,我国艾滋病感染人数到2010将达到1000万,并持续高速增长。我国60%以上的人曾受到乙肝病毒的感染,最终有1/10左右的人发展成为乙肝表面抗原阳性。另外,在所有肝炎中慢性化程度最高的丙型肝炎,发病人数也达到4000万左右。与血液安全的极端重要性相比,目前的检测手段还远远滞后于社会的需要。目前对输血安全性构成严重威胁的乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV-1)主要采用酶免疫法(Enzyme Immunoassay, EIA)进行检测。虽然经过了几代的改良,在灵敏度、特异性、精密度以及稳定性等方面取得了长足的进步,但作为一种间接滞后的检测方法,它所检测的是病毒所引发的人体抗体而不是病毒本身,因此不能够消除对“窗口期”标本的漏检,所谓“窗口期”即在被感染早期,体内还未产生抗体或抗体在检测限以下,此时的血清学检测一般为阴性,而HBV、HCV、HIV-1病毒感染产生的抗体的窗口期又特别长,其中丙型肝炎病毒(HCV)的窗口期约为66 82天,乙型肝炎病毒(HBV)和人类免疫缺陷综合症病毒I型(即艾滋病毒I型,HIV-1)的窗口期分别为约59天和22天。另外,由于病毒的突变等原因也造成了部分免疫学方法检测漏检的可能。所以免疫学诊断方法存在固有的缺陷,不能杜绝漏检——检测方法的滞后已给输血安全和临床检验带来严重威胁。近年来,核酸技术的发展和逐渐成熟为人们直接检测病毒的存在提供了最有力的工具。核酸扩增技术(Nucleic acid Amplification Technology, NAT)就是这一类技术的统称。核酸检测的是病毒基因本身,是在最根本的层面上对病毒的检测。核酸检测大大缩短了病毒检出的窗口期,并具有极高的灵敏度、特异性、精密度和稳定性。事实证明NAT检测可将HBV、HCV和HIV-1感染的平均“窗口期”分别缩短25天、59天和11天,分别缩短“窗口期”45%、89%和50%。正因为如此,越来越多的国家认识到血液核酸检测的重要性,在西欧等国家作为强制性指标在临床输血及血制品中执行,同时,美国、日本、欧盟已将NAT检测纳入献血者的常规筛查 项目。国外已有多个单项核酸检测产品投放市场。美国、澳大利亚、加拿大等国家相继有产品问世。罗氏公司也开发了核酸诊断试剂盒。但这些试剂盒要么是开放性的PCR-ELISA检测模式,要么操作繁琐、易发生检测污染,并且都是单个指标单次检测,这些缺陷使之很难适应市场现状的需要。分析这些核酸诊断试剂的现状,主要存在以下几点不足:I)试剂是开放式的,污染的可能性大;自动化程度低,而自动化和全封闭性事核酸检测最关键的技术瓶颈。2)试剂为单项检测的,没有一个血筛试剂可以同步提取、同时实时检测多种病毒核酸(如,HBV、HCV和HIV-1),如FDA批准的罗氏血液筛查试剂均为单项操作,使用的扩增程序各不相同,检测过程也不尽相同;FDA批准的另一家GEN-PR0BE公司所使用的TMA技术可以同时扩增HCV与HIV-1,但不能同时扩增HBV ;另外检测要么是不同管操作,各测各的,要么是同管操作,但一旦测定结果为阳性时却不能分辨是HCV还是HIV-1。迄今为止,美国FDA只批准过上述两个产品可用于血液核酸筛查。3)操作繁琐,重复性差,通量低,不适于临床检验和大规模的血液筛查。4)兼容性差,大多提供核酸提取试剂的厂家往往不提供扩增检测试剂或者二者不能很好的匹配,需要用户调整甚至优化;有的能提供匹配试剂,却又不一定适用于特定的核酸自动提取仪;及时上述条件得到满足,用户还要根据扩增检测试剂的要求选用指定的仪器,如 COBAS AMPLIC0R 等。5)试剂往往不是即用型的,例如使用前需要溶解干粉、在一些瓶瓶罐罐中加入指定量的乙醇或异丙醇等有机试剂,有的试剂使用前还有复杂的配制工作,稍有不慎就造成试验的彻底失败。不同人员的操作还引入试剂准备这一步骤的操作误差;并且某些试剂一旦开封后或复融后即使低温保存有效期也只有几天,尤其不适于标本量较少情况下的多批次反复使用,也不利于核酸检测在大中型医院检验科室的广泛应用,成为血液筛查和临床核酸检验方法发展的瓶颈之一。因此,本领域迫切需要开发适合于常规血液核酸筛查的自动化、高通量、多项目的同步核酸提取和实时扩增检测技术平台及可应用于规`模化生产的性能稳定、可操作性强、即用型试剂的试剂盒,并有相关的仪器、耗材与之匹配。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法,由高温变性、低温退火(复性)和适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点,不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA/RNA的地方。实时荧光定量PCR技术,即PCR荧光定量检测是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术,于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,是一种在PCR反应体系中加入荧光基团标记的探针(TaqMan探针),利用荧光信号积累的实时检测来监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术具体为利用Taq DNA聚合酶5' —3' DNA聚合酶和5' —3'核酸外切酶活性,对目的片段进行扩增及对TaqMan探针进行切割进而产生荧光信号,实现对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量,而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、单管操作无污染、实时和准确的特点,目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。荧光定量PCR检测技术有如下不足:DPCR荧光定量检测需一对扩增引物和一条TaqMan荧光探针,三条寡核苷酸序列均需保守,扩增片段长度范围100 150bp,且在引物及TaqMan探针设计方面有诸多要求和限制条件;2)PCR反应组分包括缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+浓度等诸多因素需优化;3) PCR反应耗时长;4)易产生PCR产物污染等。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5'-末端,而淬灭剂则在3'-末端。常用的荧光基团是FAM,TET, VIC和HEX等本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎核酸的试剂盒,为一种同步提取并荧光互补探针杂交同步检测肝炎和艾滋病毒的方法及试剂盒,其特征在于包含去抑制剂、裂解液、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液、内对照、2×Annealing?Buffer、荧光探针、阳性对照、阴性对照,其中,所述的去抑制剂为含蛋白酶的醇溶液;所述裂解液为裂解血清、血浆样本中病毒颗粒的异硫氰酸胍溶液,并含有由生物素修饰的寡核苷酸作为核酸提取的捕获探针;所述洗涤液为含氯化钠的溶液;所述洗脱液为低盐缓冲液;所述磁珠悬液含链亲和素包裹磁珠;所述2×Annealing?Buffer为退火缓冲液;所述荧光探针为HBV、HCV、HIV?1和内标特异性的各自两条互补的Taqman探针;所述阳性对照为含有与HBV、HCV、HIV?1荧光探针序列对应互补的一段DNA或RNA;所述阴性对照为正常献血员的血浆;所述内对照为不同于HBV、HCV、HIV?1荧光探针序列的一段内标RNA,可于内标探针特异性结合;其中:HBV的互补Taqman探针为:5′?FAM?CGA?CGA?GGC?AGG?ACC?CCT?AGA?AGA?A?NFQ?3′,5′?HEX?TTC?TTC?TAG?GGG?TCC?TGC?CTC?GTC?G?NFQ?3′;HCV的互补Taqman探针为:5′?FAM?CTG?CGG?AAC?CGG?TGA?GTA?CAC?NFQ?3′,5′?HEX?GTG?TAC?TCA?CCG?GTT?CCG?CAG?NFQ?3′;HIV?1的互补Taqman探针为:5′?FAM?CCA?TCA?ATG?AGG?AAG?CTG?CAG?AAT?GGG?ATA?NFQ?3′,5′?HEX?TAT?CCC?ATT?CTG?CAG?CTT?CCT?CAT?TGA?TGG?NFQ?3′;内标的互补Taqman探针为:5′?FAM?AAT?GTA?ACA?GAA?AAC?TTT?AAC?ATG?TGG?AAA?NFQ?3′,5′?ROX?TTT?CCA?CAT?GTT?AAA?GTT?TTC?TGT?TAC?ATT?NFQ?3′,且,每一对互补的荧光标记探针,均为FAM探针量稍多于非FAM探针量; 并将4对探针等浓度等体积混合,制成探针混合液,每条探针浓度约为5μM。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:迟大利,吴大治,夏懿,
申请(专利权)人:上海复星医学科技发展有限公司,上海复星医药集团股份有限公司,
类型:发明
国别省市:
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