从红果小檗粗提物中筛选出的1型艾滋病病毒蛋白酶抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种基于荧光底物和晶体浸泡联合筛选艾滋病病毒蛋白酶抑制剂的方法。采用生物活性跟踪测试在天然产物中逐级分离纯化出的一系列化合物组分对HIV-1蛋白酶的抑制活性，最终分离纯化出成分单一组分，这单一组分就是天然产物小分子抑制剂，通过上述方法，本发明专利技术发现红果小檗的提取物能够有效抑制HIV-1蛋白酶的活性，通过晶体浸泡的方法找到与HIV-1蛋白酶结合能力较强的小分子，然后再通过酶活测定小分子对HIV-1蛋白酶的抑制活性。最终，提供一种能够有效抑制艾滋病病毒蛋白酶活性的小分子抑制剂，并且提供一种通过小分子物质与艾滋病病毒蛋白酶复合物结合筛选抗艾滋病毒物质的方法以及艾滋病病毒蛋白酶能与抑制剂相互作用的新位点以及利用该位点筛选抗艾滋病毒活性物质的方法。

【技术实现步骤摘要】
从红果小檗粗提物中筛选出的1型艾滋病病毒蛋白酶抑制剂及其应用
本专利技术涉及一种抗艾滋病毒物质的筛选方法及其应用，具体通过荧光底物和晶体浸泡联合筛选艾滋病病毒蛋白酶抑制剂，在天然产物中采用生物活性跟踪测试分离纯化出的一系列化合物组分对HIV-1蛋白酶的抑制活性，直至最终分离纯化出成分单一的天然产物小分子抑制剂。
技术介绍
艾滋病，医学全名为“获得性免疫缺陷综合症”(AcquiredImmuneDeficiencySyndrome--AIDS)，现在科学研究普遍认为是人体感染了人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，简称HIV)所导致的传染病。艾滋病病毒属于逆转录病毒科(Retroviridae)，慢病毒(lentivirus)属，灵长类免疫缺陷亚属。现已证实HIV分为两型：HIV-1型和HIV-2型，其中IV-2主要分布于非洲西部，在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到，但毒力和传播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程较慢且较缓和。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1为主进行的。艾滋病病毒可透过直接接触黏膜组织的口腔、生殖器、肛门等或带有病毒的血液、精液、阴道分泌液、乳汁而传染。艾滋病病毒自从20世纪80年代由撒哈拉以南的非洲地区蔓延以后，至今已成为全球性的大流行病之一，目前，科学家尚未发现能够完全抵御艾滋病病毒的疫苗，也没有找到能够根治艾滋病的药物，因此，开发针对HIV的特效药物一直是一个世界性的难题。艾滋病病毒主要感染人体免疫系统内广泛存在的辅助型T细胞，巨噬细胞以及树突状细胞。病毒进入细胞内后，将启动由ReverseTranscriptease(逆转录酶)主导的转录过程，将病毒自身的单链RNA逆转录为双链DNA，然后在integrase(整合酶)的作用下，将病毒DNA插入人体自身的DNA中，跟随宿主本身DNA的复制而复制。并且利用宿主的复制机器表达自身需要的蛋白。在病毒蛋白表达完成之后，由艾滋病病毒蛋白酶将未成熟蛋白切割形成成熟的蛋白，组装得到成熟的病毒颗粒后继续感染下一个细胞。HIV的基因组主要编码了结构蛋白，调控蛋白以及辅助蛋白。其中结构蛋白包括Gag，Pol以及Env。Gag基因表达形成一段55kD的蛋白，在HIV-1Protease(艾滋病病毒蛋白酶)的作用下，切割形成四段小蛋白，分别是基质蛋白MA(p17)，衣壳蛋白CA(p24)，核衣壳蛋白NC(p9)，以及p6蛋白；Gag-Pol融合蛋白在HIV-1Protease(艾滋病病毒蛋白酶)的作用下切为四個小蛋白，分别是蛋白酶(p10)、逆转录酶(p50)、RNA酶H(p15)、及整合酶(p31)。Env最初是在内质网内合成，是一段分子量为88kD的蛋白质，在向高尔基体的转运过程中被糖基化而成为分子量160kD(gp160)的包膜糖蛋白前体。gp160被宿主体内的蛋白酶切割为gp120和gp41两部分，gp120位于感染细胞和毒粒的表面，称外膜蛋白，gp41镶嵌于病毒的脂质双层中，称跨膜蛋白，在病毒感染过程中能够介导病毒脂膜与细胞膜的融合。除此之外，HIV基因组中还编码了tat，nef，rev，vpu，vpr，vif等调控和辅助蛋白。从艾滋病病毒的生活周期和基因组成可以看出，艾滋病病毒蛋白酶对于艾滋病病毒的生存与繁殖具有至关重要的作用，如果能够有效的抑制艾滋病病毒蛋白酶的活性，那么艾滋病病毒将无法形成新的成熟的病毒颗粒，从而阻止获得性免疫缺陷症(AIDS)的发生。HIV-1蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶家族，是由两个相同亚基组成具有对称性的同源二聚体，每个亚基含有99个氨基酸。根据蛋白酶结构和底物的研究，人们在不断寻找蛋白酶特异结合的抑制剂，目前经FDA批准的PIs共9种：saquinavir，ritonavir，indinavir，nelfinavir，，amprenavir，lopinavir，atazanavir，tipranavir，darunavir。除了tipranavir外，另外8种抑制剂都是多肽类似物(生物利用率低)，竞争性抑制剂，都含有一个羟基乙烯中心结构，tipranavir则是一个二氢吡喃酮环结构。由于“鸡尾酒疗法”HAART(HighlyActiveAntiretroviralTherapy)的应用，这些抑制剂在前期治疗过程中确实能有效的抑制HIV的传播，但是由于患者要承担高昂的医药费用，较高的注射剂量，发烧，腹泻，恶心等毒副作用，以及HIV病毒高突变率产生抗药性，艾滋病一直危害人类的健康，虽然全世界众多医学研究人员付出了巨大的努力，至今尚未研制出根治艾滋病的特效药物，也没有可用于预防的有效疫苗，这也促使人们在不断寻找新的抗HIV-1药物。随着一些HIV复制过程中的重要蛋白以及这些蛋白与相关配体或抑制剂的精确三维结构的解析，基于这些蛋白的三维结构设计、筛选治疗HIV感染的药物，成为目前开发治疗HIV药物的重要手段。虽然在HIV不同的基因型、亚型以及突变体中，protease的蛋白质序列不尽相同，但是其总体组成和相关活性位点却是非常保守的，这就为我们从已解析结构的protease出发，筛选特异性针对的protease药物提供了重要的依据。天然产物又称次级代谢产物(SecondaryMetabolites)，具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现提供出来，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。利用体外药物模型筛选天然产物一直是药物或其前导物的主要来源。体外筛选一般以短肽为底物进行酶促反应，然后根据底物的有无标记和标记物的特点分别进行HPLC、放射性、荧光分析或ELISA检测。根据这些方法，人们从不同来源得到一些有抑制HIV蛋白酶活性的物质。下面我们荧光分析为例阐明现有技术：参考文献MatayoshiED，WangGT，KrafftGA，EricksonJ.Novelfluorogenicsubstratesforassayingretroviralproteasesbyresonanceenergytransfer.Science.1990Feb23；247(4945)：954-8.荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)技术测定针对HIV-1蛋白酶的抑制剂的活性，是目前最常用的一种检测方法，主要依据HIV-1蛋白酶识别位点设计并合成人工多肽底物：DABCYL-g-Abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-EDANS，当抑制剂对HIV-1蛋白酶没有抑制作用时，HIV-1蛋白酶可以切割底物Tyr-Pro之间的肽键，淬灭基团(DABCYL)远离荧光基团(EDANS)，荧光基团吸收336nm波长，激发出472nm的波长，通过检测器检测荧光强度，如果抑制剂对HIV-1蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗艾滋病病毒物质的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：(1).制备艾滋病病毒蛋白酶，并结晶得到艾滋病病毒蛋白酶的晶体；(2).制备天然产物提取物，所述提取物包括通过提取、溶剂萃取或大孔树脂、硅胶等柱层析分离纯化得到的各个部位；(3).将步骤(2)得到的天然产物提取物溶于有机溶剂；使用缓冲溶液对步骤(1)中的艾滋病病毒蛋白酶晶体溶解、稀释，然后将两种溶液混合得到混合溶液，配制荧光底物溶液，再将荧光底物溶液加入上述混合溶液中；(4).检测样品的荧光强度变化，并与不加入天然产物提取物的阴性对照品比较，得到具有抑制艾滋病病毒蛋白酶的活性天然产物提取物。

【技术特征摘要】
1.一种抗艾滋病病毒物质的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：(1).制备艾滋病病毒蛋白酶，并结晶得到艾滋病病毒蛋白酶的晶体；(2).制备天然产物提取物，所述提取物包括通过提取、溶剂萃取或大孔树脂、硅胶等柱层析分离纯化得到的各个部位；(3).将步骤(2)得到的天然产物提取物溶于有机溶剂；使用缓冲溶液对步骤(1)中的艾滋病病毒蛋白酶溶解、稀释，然后将两种溶液混合得到混合溶液，配制荧光底物溶液，再将荧光底物溶液加入上述混合溶液中；(4).检测样品的荧光强度变化，并与不加入天然产物提取物的阴性对照品比较，得到具有抑制艾滋病病毒蛋白酶的活性天然产物提取物；其中，所述艾滋病病毒蛋白酶为1型人类免疫缺陷病毒蛋白酶，制备所用HIV-1protease质粒的氨基酸序列为PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF；采用活性追踪的方法，对确定的具有活性的天然产物提取物进一步分离纯化，对分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶子和，杨诚，郭宇，唐延婷，牛国君，孙玉桃，汪颖，李智，
申请(专利权)人：天津市国际生物医药联合研究院，
类型：发明
国别省市：