本发明专利技术公开了一种蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因LDC及其编码的蛋白与应用，该基因为首次从蛇足石杉的cDNA中获得，填补了我国传统中药材蛇足石杉中分子克隆出赖氨酸脱羧酶基因的空白。本发明专利技术所提供的赖氨酸脱羧酶基因具有SEQ?ID?NO.1和SEQID?NO.3所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或者缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或者缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明专利技术提供的赖氨酸脱羧酶基因有可能通过生物技术提高蛇足石杉中生物碱类活性成分石杉碱甲的含量，或者进行品种选育，具有较好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，主要涉及通过合成蛇足石杉cDNA、PCR和重组表达技术获得赖氨酸脱羧酶基因及其编码产物，属于药用植物基因工程领域。
技术介绍
药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。蛇足石杉是石松类石松科石松属植物,作为传统中草药在我国民间已有上千年的用药历史，其所含石杉碱甲次生代谢物是一类高效、低毒、可逆且具有选择性的乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂，治疗重症肌无力和早老年性痴呆疗症效显著，是新一代炙手可热的治疗老年痴呆的药物。目前所知在蛇足石杉石松类生物碱生物合成途径中，赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC)是蛇足石杉石杉碱甲合成途径的第一个酶，是植物次生代谢途径的关键酶之一，对蛇足石杉具有非常重要的生理意义。因此赖氨酸脱羧酶基因的获得，为用基因工程手段提高蛇足石杉有效部位的含量提供重要基础。在本次专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因及其氨基酸序列。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因(LDC)。本专利技术的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。本专利技术还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。本专利技术的另一个目的在于提供该基因的应用。本专利技术所提供的蛇足石杉赖氨酸脱羧酶(LDC)，为以下核苷酸序列之一:(I) SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.3 的 DNA 序列；(2)在严格条件下与SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3的DNA序列杂交且编码具有蛇足石杉赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质分子的DNA分子；(3)编码SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4所示氨基酸序列的核苷酸序列；(4)编码对SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有蛇足石杉赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质的核苷酸序列。本专利技术所提供的蛇足石杉赖氨酸脱羧酶(LDC)，其特征在于，是以下氨基酸序列之具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；SEQ ID N0.2和 SEQ ID N0.4经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有蛇足石杉赖氨酸脱羧酶活性的序列；含有本专利技术的蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因全序列或部分序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本专利技术的保护范围；含有本专利技术的蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因全序列或部分序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围；所述宿主细胞为有价值的活性材料。本专利技术的蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因全序列或部分序列转化获得转基因生物体。本专利技术技术方案中涉及的概念具体内容如下:所说的蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的DNA分子包括:编码具有赖氨酸脱羧酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55°C条件下与SEQ IDN0.1和SEQID N0.3中从核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID N0.1中从核苷酸第1-639位和SEQ ID N0.3中从核苷酸第1-609位的核苷酸序列。本专利技术分离出的蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因多肽包括:具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4序列的多肽。 本专利技术中术语“蛇足石杉赖氨酸脱羧酶(或多肽)”基因(LDC)指:编码具有蛇足石杉赖氨酸脱羧酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1中第1-639位核苷酸序列及简并序列，和SEQ ID N0.3中第1-609位核苷酸序列及简并序列。该简并序列是指，位于SEQID N0.1序列编码框第1-639位和SEQ ID N0.3序列编码框第1_609位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0.2和和SEQ ID N0.4所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的蛇足石杉赖氨酸脱羧酶相同功能的蛋白的SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为，1-90个，较佳地，1-60个，更佳地1-20个，最佳地，1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。本专利技术术语“蛇足石杉赖氨酸脱羧酶蛋白或多肽(LDC) ”指:具有蛇足石杉赖氨酸脱羧酶活性的SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4序列的多肽。该术语还包括具有与天然蛇足石杉赖氨酸脱羧酶相同功能的SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。有比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括蛇足石杉赖氨酸脱羧酶的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。本专利技术的蛇足石杉赖氨酸脱羧酶多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导变异体、在高或低的严谨条件下能与蛇足石杉赖氨酸脱羧酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用蛇足石杉赖氨酸脱羧酶多肽的血清获得的多肽或蛋白。本专利技术中蛇足石杉赖氨酸脱羧酶保守性变异多肽指:与SEQ ID N0.2和SEQIDN0.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因LDC，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一：?(1)SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.3的DNA序列；?(2)在严格条件下与SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.3的DNA序列杂交且编码具有?蛇足石杉赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质分子的DNA分子；?(3)编码SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列；?(4)编码对SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.4经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有蛇足石杉赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭清忠，杜次，朱越，李菁，
申请(专利权)人：吉首大学，
类型：发明
国别省市：
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