DNA疫苗制造技术

本发明专利技术涉及生物工程疫苗领域，尤其是涉及髓鞘相关蛋白在制备针对中枢神经系统的生物工程DNA疫苗中的应用及包含编码所述髓鞘相关蛋白的DNA片段的疫苗和疫苗制备方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一方面涉及生物医药研究领域，尤其是涉及髓鞘相关蛋白在阿尔茨海默病中的病理作用及作为药物靶点的价值研究；另一方面涉及生物工程疫苗领域，尤其是涉及髓鞘相关蛋白在制备针对中枢神经系统的生物工程DNA疫苗中的应用及包含编码所述髓鞘相关蛋白的DNA片段的疫苗和疫苗制备方法。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease,AD)是以 P 淀粉样沉淀(P-Amyloid,A3 )和tau过度磷酸化形成的神经纤维缠结(Neurofibullar tangels)为主要病理标志的神经退行性疾病。AP和tau过度磷酸化都会对细胞造成毒性损害。然而，目前针对AP和tau的药物在临床试验中的效果并不理想。因此，利用一些有神经保护、促进变性神经再生以及促进神经可塑性重建的治疗手段有可能是目前治疗AD更有效的措施。髓鞘及其相关蛋白在神经再生中起着重要的作用。受损伤后，中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)神经轴索无法再生导致永久性的损伤。这种对神经纤维再生的抑制很大程度上是由于髓鞘相关蛋白阻碍轴索再生引起的(Mukhopadhyay等人1994;Xie and Zheng 2008)。髓鞘相关蛋白-A型勿动蛋白(Nogo-A)、髓鞘磷脂相关糖蛋白(Myelin-associated glycoprotein, MAG)和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(Oligodendrocyte-myelin glycoprotein, OMgp),位于有髓纤维的节旁区，是抑制神经再生的髓鞘的主要组成蛋白(Domenicon1.，2002 ；Liu.，2002 ；ffang.，2002 ；Fournier.,2001 ；Chen.，2000 ；GrandPre.，2000 ；Prinjha.，2000 ；McKerracher.，1994 ；Mukhopadhyay.，1994)。它们通过共同的受体NgR，通过统一信号通路对神经再生起着抑制作用。Tenasin-C(TNC)，Tenasin-R(TNR)，位于有髓纤维的朗飞氏节上，它们在调节神经再生及神经可塑性中发挥着重要的作用(Apostolova等人2006 ；Xu等人2004 ；Rauch2004)。近年来发现，髓鞘有可能直接参与阿尔茨海默病的病理发生发展。在阿尔茨海默病早期的病人脑内，甚至还没有出现明显临床症状的时候，已经能够检测到髓鞘的异常变化了。而且，髓鞘出现异常的区域恰恰是阿尔茨海默病病人最容易受影响的脑区(Benes2004 ；Bartzokis 2004)。另外，研究发现，髓鞘在经验依赖性的神经突触可塑性调节中发挥着重要作用(McGee等人2005)。这说明髓鞘及其相关蛋白有可能亦是治疗阿尔茨海默病或其他中枢神经系统退行性病变的药物靶点。我们研究结果显示Nogo-A、MAG、`OMgp、TNC和TNR可能对阿尔茨海默病(Alzheimer，s Disease, AD)病理起重要作用(见正文)。DNA疫苗是一种新型疫苗。它利用载体表达编码目的蛋白的DNA序列。DNA疫苗具有安全性好、稳定性高、易设计、易大规模生产、并能诱导T细胞和B细胞介导的细胞和体液免疫等优势(Kutzler 和 Weiner，2008)。Nogo-A、MAG、OMgp, TNC 和 TNR 抑制神经再生。阻断以上分子不仅可以促进神经再生，并对神经元有保护作用。目前，在试图消除分子的抑制性作用方面已经取得了不同程度的成功(Huang等人1999 ;Sicotte等人2003 ;Xu等人2004 ；Bourquin等人2008)。专利技术人以前报道的利用编码MAG、TN-R和Nogo-A重组DNA疫苗治疗脊髓损伤的模型大鼠，发现该疫苗对脊髓损伤后大鼠的行为及神经再生都有很强的改善作用。疫苗接种后8周将脊髓背侧半横断损伤，与对照组相比，接种疫苗组产生了健康的皮质脊髓束轴索的再生(CST) (Xu等人2004)。接种该DNA疫苗对神经再生的促进作用，在创伤性脑损伤的动物模型上也得到了验证(张等人2008)。部分机制研究发现，编码髓鞘相关蛋白的这种DNA疫苗可以调控棘突神经生长因子的表达，并通过其神经保护作用实现(张等人2009)。脊髓损伤、创伤性脑损伤和其他的中枢神经系统退行性病变如中风、阿尔茨海默病在病理机制及治疗机理上存在 着很多相似之处。例如，神经保护、神经再生、神经突触可塑性的调控都是治疗以上几种疾病的主要调控方向。本专利技术发现，Nogo-A, MAG、OMgp, TNC和TNR可能是治疗AD的祀点。基于此，本专利技术构建了编码Nogo-A、MAG、0Mgp相关抗原片段的基因疫苗，并在APP/PS1双转基因模型小鼠上对该疫苗的安全性和有效性进行了综合的评价。结果显示，该疫苗在APP/PS1双转基因模型小鼠模型上，延缓了 AD的病理进展，有效提高和改善了模型小鼠的神经突触可塑性及认知学习障碍。
技术实现思路
本专利技术提供的数据明确地阐述了髓鞘相关蛋白Nogo-A、MAG、Omgp, TNC和TNR在阿尔茨海默病中的病理机制。并在研究基础上，开发出编码Nogo-A、MAG和OMgp相关抗原表位片段的新型DNA疫苗。这种疫苗在阿尔茨海默病模型小鼠APP/PS1上可以预防和治疗阿尔茨海默病的病理发展。本专利技术的目的在于提供髓鞘相关蛋白Nogo-A、MAG、Omgp, TNC和TNR在阿尔茨海默病病理机制的实验数据；编码髓鞘源性蛋白的DNA疫苗及其制备方法和用途。本专利技术的一方面在于发现髓鞘相关蛋白Nogo-A、MAG、Omgp, TNC和TNR参与阿尔茨海默病的病理发展，并发现它们是治疗阿尔茨海默病的新的药物靶点。本专利技术的一方面在于提供一 DNA疫苗，所述疫苗主要由编码大鼠MAG的l_5Ig区域、编码小鼠OMgp胞外8个脂质体受体样蛋白(8LRP)、编码人bNogo-A的N端、编码人Nogo-A胞外端的66个氨基酸的DNA片段构成。本专利技术的又一方面还在于提供制备这些疫苗的方法，所述方法包括如下步骤:1，构建重组质粒，将所述疫苗各自的基因片段顺序连接并亚克隆到载体质粒，2，由限制性内切酶进行双酶切。3，丙氨酸连接子位于两个相邻结构域之间便于多肽折叠，4，通过PCR和测序检查合成产物，确认所得产物为所需DNA疫苗。5，利用电转染的方法，对疫苗进行免疫。进一步地，本专利技术的载体质粒为pcDNA 3.1+(Invitrogen公司，卡尔斯巴德,CA,美国)，所述限制性内切酶为BamHI和Xbal。本专利技术的再一方面在于提供所述DNA疫苗在预防中枢神经系统病变中的应用，所述中枢神经系统包括但不限于以下疾病:阿尔茨海默病、多发性硬化、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风以及脑肿瘤等。附图说明图1所示为APP与MAG、Nogo_A等分子相结合的示意图。图A:用抗APP、Nogo_A抗体免疫沉淀小鼠脑勻衆，所得样品进行蛋白电泳和western-botting分析；图B:用抗APP、MAG抗体免疫沉淀小鼠脑勻衆,所得样品进行蛋白电泳和western-bot分析。IP:免疫共沉淀；IB:免疫印迹；moCk:在免疫沉淀的时候没有加抗体；Input:小鼠脑蛋白匀浆。图2所示为在AD病人不同脑区(颞叶、胼胝体、本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA疫苗，所述疫苗包含编码大鼠MAG的1?5Ig区域的DNA片段、编码小鼠OMgp胞外8个脂质体受体样蛋白的DNA片段、编码人Nogo?AN端的DNA片段和编码人Nogo?A胞外端的66个氨基酸的DNA片段。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马全红，肖志成，
申请(专利权)人：马全红，肖志成，
类型：发明
国别省市：