本发明专利技术属于兽医生物新医药技术领域，涉及一种猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法。该疫苗所用菌种免疫原性好，采用1次单剂量2.0ml肌肉注射，免疫持续期可达6个月，能够有效预防猪肺炎支原体疾病发生。本发明专利技术解决了国内弱毒活疫苗操作复杂不易推广的问题，填补了国内自主研发猪支原体肺炎灭活疫苗的空白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽医生物新医药
，涉及。
技术介绍
猪支原体肺炎，又称猪喘气病或猪地方流行性肺炎，是由猪肺炎支原体引起的一种接触性慢性呼吸道传染病。患病猪的主要临床症状为咳嗽和气喘，体温基本正常，生长迟缓，饲料转化率低。剖检时，以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。该病存在于世界各地，其死亡率虽然不高，但由于流行的广泛性、长期性和消耗性，可使饲料转化率降低，并引起猪的多种并发病，是造成养猪业经济损失的最重要的疾病之一。目前，该病的控制有改善饲养条件、药物治疗和疫苗免疫3种方式。改善饲养条件和药物治疗都不能根除该病的发生，且抗生素治疗存在耐药性问题，疫苗免疫是首选、有效的控制方式。国内自主研发的疫苗只有弱毒活疫苗，包括中国兽医药品监察所研制的兔肺冻干苗、乳兔肌肉冻干苗及鸡胚卵黄囊冻干苗，南京天邦和江苏省农科院共同研制的猪支原体肺炎168株活疫苗。弱毒活疫苗由于需要胸腔接种，所以不易于推广普及；国外已有多家兽药公司研发生产了猪支原体肺炎灭活疫苗，如梅里亚有限公司、美国先灵葆雅动物保健公司和美国富道公司等，均通过肌肉注射进行接种，易于操作，但其价格较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪支原体肺炎灭活疫苗，该疫苗免疫效果显著，能够有效预防猪肺炎支原体疾病发生，填补了国内自主研发猪支原体灭活疫苗空白，解决了弱毒活疫苗操作复杂、不易推广的问题。本专利技术的另一目的是提供该猪支原体肺炎灭活疫苗的制备方法。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的:本专利技术提供一种猪支原体肺炎灭活疫苗，该疫苗所用的菌种为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae) DJ-166株,菌种的保藏号为CGMCC N0.4545,上述菌种经灭活后作为水相，佐剂作为油相，水相与油相按配比乳化而成。其中，所述的佐剂为矿物油佐剂。进一步，矿物油佐剂为白油、206佐剂、50V佐剂(即MontanideISA 50V佐剂)中的任一种。本专利技术的猪支原体肺炎灭活疫苗中水相与油相按1:1 1: 3体积配比进行乳化。进一步， 水相与油相按1:1体积配比进行乳化。本专利技术制备的疫苗每头份疫苗抗原含量不小于lOOug。进一步，每头份疫苗抗原含量为100 500ug。更进一步,每头份疫苗抗原含量为300ug。本专利技术免疫接种方式为每头猪I次肌肉注射2.0毫升，免疫期为6个月；种猪群每半年重复接种一次。本专利技术还提供了该猪支原体肺炎灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下:(1)制备猪肺炎支原体DJ-166株菌液，培养至菌液pH值降至6.5 7.0 ;A.菌液培养按培养基量的8% 10%接种菌液，置37±1°C培养5 9日，待培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，pH值降至6.50 7.00之间收获菌液。B.纯粹检验按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。C.CCU 测定将收获菌液接种液体培养基，并进行10倍系列稀释至10_12，置37± 1°C培养14日，活菌滴度应≥108CCU/mL。(2)将步骤(1)得到的菌液进行浓缩、纯化，并进行灭活；A.浓缩、纯化将菌液以10000r/min离心30分钟，弃掉上清液，沉淀菌体用PBS(pH7.2 7.4)缓冲液悬浮，配制成为原培养物体积1/100菌悬液，-40°C保存。B.灭活经浓缩的菌液加入1.0%的硫柳汞溶液使其终浓度为0.01 %，混合均匀，2 8°C放置12 24小时，期间振摇1 3次，然后在冰水浴上超声波裂解4 6次，每次I分钟，功率250 300W，超声5 8秒，间歇5 8秒。(3)将灭活后的菌液进行半成品检验，包括:无菌检验，灭活检验和蛋白浓度测定;A.灭活检验取5.0ml灭活菌液接种于45ml液体培养基，置37°C培养14日，观察培养基颜色变化。同时设未灭活菌液为阳性对照，液体培养基为阴性对照。培养5 7日，取出0.2ml接种固体培养基，置5% CO2环境，37°C培养10日。液体培养基应无颜色变化，固体培养基上应无菌落生长为灭活完全。B.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌生长。C.蛋白浓度测定用紫外分光光度计检测样品在260nm和280nm波长下的吸收值,计算:蛋白浓度(mg/mL) = 1.45 X OD280-0.74X OD260, OD260/OD280 < 1.4。(4)将步骤(3)得到的灭活后的菌液与佐剂按比例配比乳化，得到猪支原体肺炎灭活疫苗。A.水相制备将灭活菌液用PBS (pH7.2 7.4)缓冲液稀释，每头份疫苗蛋白抗原含量应不低于100 μ gB.油相制备将矿物油佐剂装入灭菌瓶内，在121°C灭菌30分钟，冷却后备用。C.乳化将水相与油相按1:1 1: 3的体积比配比乳化。先将油相加入剪切机内，在低速搅拌的同时缓缓加入水相后，以lOOOOr/min搅拌5 8分钟，即成乳白色油乳剂灭活疫苗。有益效果:本专利技术的疫苗采用I次单剂量2.0ml肌肉注射，操作简便；该疫苗所用菌种免疫原性好，免疫持续期可达6个月，能够有效预防猪肺炎支原体疾病发生。本专利技术疫苗解决了国内弱毒活疫苗操作复杂、不易推广的问题，填补了国内自主研发猪支原体肺炎灭活疫苗的空白。本专利技术疫苗所用的菌种猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)DJ-166株为申请人从山西养猪场35日龄二元杂交病猪肺脏组织分离得到，其免疫原性好。本专利技术的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株申请人已于2011年01月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，保藏编号为=CGMCC N0.4545。附图说明图1抗体消长曲线图具体实施例方式实施例1猪支原体肺炎灭活疫苗的制备(I)菌(CGMCC N0.4545)液制备A.菌液培养按培养基量10%比例接种猪肺炎支原体CGMCC N0.4545菌液，置37土 1°C培养5日，培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，PH值降至7.00收获菌液。B.纯粹检验按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。C.CCU 测定取收获的菌液接种液体培养基，并进行10倍系列稀释至10_1(1，置37±1°C培养14日，活菌滴度为101QCCU/ml。D.浓缩、纯化将菌液以10000r/min离心30分钟，弃掉上清液，沉淀菌体用PBS(pH7.2 7.4)缓冲液悬浮，配制成为原培养物体积1/100菌悬液，-40°C保存。E.灭活经浓缩的菌液加入1.0%的硫柳汞溶液使其终浓度为0.01 %，混合均匀，2 8°C放置12小时，期间振摇I次，然后在冰水浴上超声波裂解4次，每次I分钟(功率250 300W，超声5秒，间歇5秒)。(2)半成品检验A.灭活检验取5.0ml灭活菌液接种于45ml液体培养基，置37°C培养14日，观察培养基颜色变化。同时设未灭活菌液为阳性对照，液体培养基为阴性对照。培养5 7日，取出0.2ml接种固体培养基，置5% CO2环境，37°C培养10日。液体培养基应无颜色变化，固体培养基上应无菌落生长为灭活完全。B.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无细菌、霉菌生长。C.蛋白浓度测定用紫外分光光度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于菌种为猪肺炎支原体(Mycoplasma?hyopneumoniae)DJ?166株，菌种的保藏号为CGMCCNo.4545，上述菌种经灭活后作为水相，佐剂作为油相，水相与油相按配比乳化而成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：车艳杰，王海燕，张锋，王勇鹣，闫国晖，高玉梅，石松，高洁，赵亚荣，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，福州大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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