异源蛋白质的植物基制备制造技术

本文描述了病毒扩增子基蛋白质表达系统以及通过农杆菌真空渗透法来制备异源蛋白质的方法，其中所述的异源蛋白质例如为酶。所述的方法涉及使用编码异源蛋白质的Ti质粒来制备土壤杆菌属，使用该土壤杆菌属来感染植物细胞，允许异源蛋白质表达，以及由植物细胞回收异源蛋白质。在一个实施方案中，所制备的蛋白质为内切葡聚糖酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开总体而言涉及异源蛋白质的植物基制备，更具体而言，涉及异源蛋白质的在植物体中制备。2.相关技术的说明 诸如乙醇之类的生物燃料是由葡萄糖发酵得到的，并且生物质中的纤维素是这种糖的潜在来源。然而，需要一组协同作用的酶来将纤维素降解为葡萄糖。通常，这些酶是通过真菌细胞培养制备的，这种真菌细胞培养需要高的资金成本以及大量的生物反应器。因此，需要更有效的酶制备系统，该系统需要较少的资金成本、消耗较少的能量，并释放较少的二氧化碳。专利技术概述本公开的组合物和方法通过促进异源蛋白质的高产率、低成本的在植物体中制备(例如纤维素酶)而解决了这种需要。在植物体中制备细胞壁降解酶可以减轻对昂贵且能量密集型的制备生物质发酵所用的纯化纤维素酶的需要，并由此帮助降低制备成本且改善生物燃料制造方法的能量平衡。具体而言，本公开提供了植物病毒基系统，其能够瞬时在植物体中表达异源蛋白质，例如纤维素酶。本公开进一步提供了使用此类植物病毒基表达系统来在植物中制备高产率异源蛋白质的方法。本公开的一个方面提供了能够表达异源蛋白质的植物细胞，其中所述的植物细胞包括被多于I种质粒编码的完整的病毒扩增子。扩增子包括多个扩增子节段。扩增子能够扩增编码所关注的异源蛋白质的核酸序列的转录。扩增子包括至少2种质粒，其中第一质粒不同于第二质粒。第一质粒包括至少一个含有核酸序列的扩增子节段，其中所述的核酸序列编码了异源蛋白质，并且第二质粒包括至少一个扩增子节段。在一些实施方案中，病毒扩增子为黄瓜花叶病毒组扩增子，并且在具体的实施方案中，扩增子为黄瓜花叶病毒(CMV)扩增子。在一些实施方案在红，病毒扩增子为通过2种质粒编码的二份系统。在优选的实施方案中，第一质粒包括CMV RNA3扩增子节段，其中RNA3包括编码异源蛋白质的核酸序列。在另一个优选的实施方案中，第二质粒包括CMV RNAl和RNA2扩增子节段。在一些具体的实施方案中，第二质粒包括启动子序列，该启动子序列响应于化学诱导剂并且可操作地与编码病毒蛋白质的核酸序列连接。在一些具体的实施方案中，化学诱导剂为雌二醇或甲氧虫酰肼。在一些具体的实施方案中，病毒蛋白质为复制酶或复制酶亚单元。在一些具体的实施方案中，第二质粒包括卡那霉素选择标志物，并且第一质粒不包括卡那霉素选择标志物。在一些实施方案中，病毒扩增子为通过3种质粒编码的三份系统。在优选的实施方案中，第一质粒包括CMV RNA3扩增子节段，其中RNA3包括编码异源蛋白质的核酸序列。在另一个优选的实施方案中，第二质粒包括CMV RNAl扩增子节段，并且第三质粒包括CMVRNA2扩增子节段。本公开的另一个方面提供了能够表达异源蛋白质的植物细胞，其中所述的植物细胞包括完整的病毒扩增子 ，该完整的病毒扩增子包括得自多于一个的病毒亚组的扩增子节段。在优选的实施方案中，病毒扩增子为CMV扩增子，扩增子节段RNA3得自CMV亚组II的菌株，并且扩增子节段RNAl和RNA2得自CMV亚组I的菌株，例如California亚组I的菌株。在一些实施方案中，CMV RNA3扩增子节段包括RNA4节段，该RNA4节段具有经修饰的5’-引导序列，与相应的野生型RNA5’-引导序列相比，经修饰的5’-引导序列包含更多的限制性酶切位点。在一些实施方案中，异源蛋白质为分泌的蛋白质。在其他实施方案中，异源蛋白质为GFP或RFP。在其他实施方案中，异源蛋白质为能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。在一些具体的实施方案中，所述的酶在> 30°C的温度下具有最佳的活性。在一些具体的实施方案中，所述的酶为纤维素酶。在一些具体的实施方案中，纤维素酶为内切葡聚糖酶、夕卜切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。在优选的实施方案中，内切葡聚糖酶为得自解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)的El β-1,4-内切葡聚糖酶。在一些实施方案中，包括编码异源蛋白质的核酸序列的扩增子节段进一步包括与编码异源蛋白质的核酸序列可操作地连接的CaM35S启动子。植物细胞可以形成细胞培养物、切除的植物组织或完整植物的一部分。在一些实施方案中，植物细胞为烟草、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果的植物细胞。在具体的实施方案中，植物细胞为烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)的细胞。在一些实施方案中，植物细胞还包括编码基因沉默抑制子的cDNA。在一些实施方案中，基因沉默抑制子为RNA-沉默抑制子(RSS)。在一些实施方案中，RSS为辅助成分蛋白酶HC-Pix)。在一些实施方案中，基因沉默抑制子得自番茄茂密矮小病毒(TBSV)或烟草蚀刻病毒(TEV)。在一些实施方案中，与野生型植物细胞相比，所述的植物细胞为表达高水平的基因沉默抑制子的转基因植物细胞。在一些实施方案中，病毒扩增子可以在植物体中复制并系统性地移动。在一些具体的实施方案中，植物包括包括编码突变形式的CMV 3a移动蛋白的cDNA。在优选的实施方案中，突变形式的CMV3a移动蛋白包括C-末端33个氨基酸的删除。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)将植物细胞、植物或切除的植物组织与细菌细胞相接触，这种细菌细胞包括完整的病毒扩增子，其中扩增子包括多个扩增子节段，并且扩增子能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；ii)在植物细胞中允许足够的时间来制备异源蛋白质；以及iii)收获至少0.5毫克异源蛋白质/千克鲜重的植物细胞、植物或切除的植物组织。在一些实施方案中，至少0.5毫克为至少1.0毫克。在一些实施方案中，至少1.0毫克为至少1.5毫克。在一些实施方案中，至少1.5毫克为至少2.0毫克。在一些实施方案中，至少2.0毫克为至少3.0毫克。在一些实施方案中，至少3.0毫克为至少4.0毫克。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)将植物细胞与至少一种植物激素相接触；ii)将植物细胞与细菌细胞相接触，该细菌细胞包括完整的病毒扩增子，其中扩增子包括多个扩增子节段，并且该扩增子能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；iii)在植物细胞中允许足够的时间来制备异源蛋白质；以及iv)收获由植物细胞制备的异源蛋白质。在一些实施方案中，至少一种植物激素为至少两种植物激素。在一些实施方案中，至少一种植物激素选自茉莉酸、赤霉素A3、吲哚乙酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸、激动素和水杨酸。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)以机械方式创伤植物或切除的植物组织；ii)将植物或切除的植物组织与细菌细胞相接触，该细菌细胞包括完整的病毒扩增子，其中扩增子包括多个扩增子节段，其中该扩增子能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；iii`)在植物细胞中允许足够的时间来制备异源蛋白质；以及iv)收获由植物细胞制备的异源蛋白质。在一些实施方案中，植物或切除的植物组织通过使用刷子压制植物或切除的植物组织而以机械方式受到创伤。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)在第一温度下将植物细胞与细菌细胞相接触，其中细菌细胞包括完整的病毒扩增子，并且该扩增子包括多个扩增子节段并且能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；ii)在第二温度下将植物细胞温育足够的时间，从本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.19 US 61/399,905;2010.07.19 US 61/399,9041.一种能够表达异源蛋白质的植物细胞，该植物细胞包含: 病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录，所述的扩增子包含: 1.包含至少一个扩增子节段的第一质粒，其中所述的至少一个节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列；以及 .包含至少一个扩增子节段的第二质粒； 其中所述的第一质粒不同于所述的第二质粒。2.权利要求1所述的细胞，其中所述的扩增子包含第三质粒，所述的质粒包含至少一个扩增子节段，其中所述的第三质粒不同于所述的第一质粒和所述的第二质粒。3.权利要求1所述的细胞，其中所述的第一质粒包含至少一个不被所述的第二质粒所包含的扩增子节段。4.权利要求1所述的细胞，其中所述的第二质粒包含至少一个不被所述的第二质粒所包含的扩增子节段。5.权利要求1所述的细胞，其中所述的第一质粒包含卡那霉素选择标志物基因，并且所述的第二质粒不包含所述的卡那霉素选择标志物基因。6.权利要求1所述的细胞，其中所述的病毒扩增子为黄瓜花叶病毒组扩增子。7.权利要求6所述的细胞，其中所述的黄瓜花叶病毒组扩增子为CMV扩增子。8.权利要求1所述的细胞 ，其中所述的第一质粒的至少一个扩增子节段为CMVRNA3。9.权利要求8所述的细胞，其中所述的CMVRNA3包含片段RNA4，其中所述的RNA4包含经修饰的5’ -前导序列，与野生型RNA4 5’ -前导序列相比，所述的经修饰的5’ -前导序列具有更多的限制性酶切位点。10.权利要求8所述的细胞，其中所述的第二质粒的至少一个扩增子节段为CMVRNAI,并且所述的第三质粒的至少一个扩增子节段为CMVRNA2。11.权利要求1所述的细胞，其中所述的第二质粒的至少一个扩增子节段为2个扩增子节段。12.权利要求11所述的细胞，其中所述的2个扩增子节段为CMVRNAl和CMV RNA2。13.权利要求1所述的细胞， 其中所述的第一质粒的所述的至少一个扩增子节段得自第一个病毒亚组；以及 其中所述的第二质粒的所述的至少一个扩增子节段得自第二个病毒亚组。14.权利要求1所述的细胞， 其中在所述的第二质粒上的至少一个扩增子节段包含响应于化学诱导剂的启动子序列；以及 其中所述的启动子序列与编码病毒蛋白质的核酸序列可操作地连接。15.权利要求14所述的细胞，其中所述的化学诱导剂为雌二醇或甲氧虫酰肼。16.权利要求14所述的细胞，其中所述的病毒蛋白质为复制酶或复制酶亚单元。17.权利要求1所述的细胞，其中编码所述的异源蛋白质的核酸序列经密码子优化。18.权利要求1所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为分泌蛋白质。19.权利要求1所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为GFP或RFP。20.权利要求1所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。21.权利要求20所述的细胞，其中所述的酶在>30°C的温度下具有最佳的活性。22.权利要求20所述的细胞，其中所述的酶为纤维素酶。23.权利要求22所述的细胞，其中所述的纤维素酶为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。24.权利要求23所述的细胞，其中所述的内切葡聚糖酶为得自解纤维热酸菌的ΕΙβ-1,4-内切葡聚糖酶。25.权利要求23所述的细胞，其中所述的木聚糖酶得自解纤维热酸菌。26.权利要求1所述的细胞，其中所述的扩增子节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列，所述的扩增子节段进一步包含与编码所述的异源蛋白质的核酸序列可操作地连接的CaM 35S启动子。27.权利要求1所述的细胞，进一步包含编码基因沉默抑制子的cDNA。28.权利要求27所述的细胞，其中所述的基因沉默抑制子为Hc-Ρι 。29.权利要求1所述的细胞，进一步包含编码病毒外壳蛋白质的cDNA。30.权利要求1所述的细胞，进一步包含编码突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白的cDNA。31.权利要求 30所述的细胞，其中所述的突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白包含C-末端33个氨基酸的删除。32.权利要求1所述的细胞，其中所述的第一质粒和所述的第二质粒为T-DNA质粒。33.一种能够表达异源蛋白质的植物细胞，该植物细胞包含: 病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录，所述的扩增子包含: 1.得自第一病毒亚组的第一扩增子节段；以及 .得自第二病毒亚组的第二扩增子节段； 其中所述的第一或第二扩增子节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列。34.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子进一步包含第三扩增子节段，其中所述的第三扩增子节段得自所述的第一或第二病毒亚组。35.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子在单一质粒上编码。36.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子由两种质粒编码，其中所述的第一质粒包含得自第一病毒亚组的两个扩增子节段，并且所述的第二质粒包含得自第二病毒亚组的一个扩增子节段。37.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子由三种质粒编码，其中所述的第一质粒包含得自第一病毒亚组的一个扩增子节段，并且所述的第二和第三质粒均包含得自第二病毒亚组的一个扩增子节段。38.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子为黄瓜花叶病毒组扩增子。39.权利要求38所述的细胞，其中所述的病毒扩增子为CMV扩增子。40.权利要求33所述的细胞，其中所述的第一扩增子节段为得自CMV亚组II的RNA3。41.权利要求40所述的细胞，其中RNA3包含片段RNA4，其中所述的RNA4包含经修饰的5’ -前导序列，与野生型RNA4 5’ -前导序列相比，所述的经修饰的5’ -前导序列具有更多的限制性酶切位点。42.权利要求33所述的细胞，其中所述的第二扩增子节段为得自CMV亚组I的RNAl或RNA2。43.权利要求42所述的细胞，其中所述的CMV亚组I为California亚组I。44.权利要求33所述的细胞，其中编码所述的异源蛋白质的核酸序列经密码子优化。45.权利要求33所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为分泌蛋白质。46.权利要求33所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为GFP或RFP。47.权利要求33所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。48.权利要求47所述的细胞，其中所述的酶在>30°C的温度下具有最佳的活性。49.权利要求47所述的细胞，其中所述的酶为纤维素酶。50.权利要求49所述的细胞，其中所述的纤维素酶为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。51.权利要求50所述的细胞，其中所述的内切葡聚糖酶为得自解纤维热酸菌的ΕΙβ-1,4-内切葡聚糖酶。52.权利要求50所述的细胞，其中所述的木聚糖酶得自解纤维热酸菌。53.权利要求33所述的细胞，其中所述的扩增子节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列，所述的扩增子节段进一步包含与编码所述的异源蛋白质的核酸序列可操作地连接的CaM 35S启动子。54.权利要求33所述的细胞，进一步包含编码基因沉默抑制子的cDNA。55.权利要求54所述的细胞，其中所述的基因沉默抑制子为Hc-Pro。56.权利要求33所述的细胞，进一步包含编码突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白的cDNA。57.权利要求56所述的细胞，其中所述的突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白包含C-末端33个氨基酸的删除。58.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子能够在植物体中复制并系统性地移...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·黄，B·E·林登穆斯，K·A·麦克唐纳，A·M·丹德卡尔，B·W·福克，Sk·郑，N·J·金斯伯里，
申请(专利权)人：加州大学评议会，
类型：
国别省市：