具有溶血栓和抗凝血性质的蛋白融合构建体制造技术

本发明专利技术公开了具有纤溶酶原活化剂性质和抗血栓性质(包括凝块特异性作用)的新的杂合蛋白，所述性质使得它们非常有利地用于治疗涉及纤维蛋白凝块形成的循环病症，所述维蛋白凝块形成归因于血管中的基础组织损伤，导致心肌梗塞、卒中等。也公开了新蛋白和得到它们的方法，所述蛋白通过以纤溶酶或凝血酶依赖性的方式活化纤溶酶原来帮助溶解血块，并且还通过固有的血液凝固途径抑制凝血酶的活性和产生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及溶血栓药物，其包括包含溶血栓蛋白以及血栓调节蛋白的4、5、6表皮生长因子样结构域(EGF4、5、6)的嵌合融合蛋白。本专利技术的融合蛋白具有纤溶酶原活化活性、凝血酶抑制活性和抗凝蛋白C途径活化活性。本专利技术的融合蛋白具有破碎血栓和预防在凝块部位处再闭塞的治疗潜力。
技术介绍
血栓形成(血块或血栓在血管系统内的形成和发展)尽管当发生在出血过程中时是一个挽救生命的过程，但是当发生在任意其它时间时可以是危及生命的。血栓可以阻塞血管，并阻止向器官或其它身体部分的血液供给。如果脱离的话，血栓可以变成栓塞物，并阻塞在起始部位远端的血管。血栓性病症现在构成世界范围内的发展中国家和发达国家的主要死亡原因之一。尽管仍然是针对血栓性循环病症的最优选急诊(“S0S”)药物，纤溶酶原活化剂蛋白药物(诸如链激酶(SK)、葡萄球菌激酶(SAK)和组织纤溶酶原激活物(tPA))在富裕的国家中正在慢慢地丧失它们在急诊心脏介入(诸如支架和旁路手术)中的优势，这是因为与它们的应用有关的出血风险，以及经常遇到的、由凝血酶活性和/或凝血酶新产生引起的在相同血管损伤部位处的凝块再形成的问题。因而，迫切需要开发具有额外特征(诸如凝块特异性和抗血栓性质)的更智能的和更有效的溶血栓药物。血块形成是级联反应的复杂组合的最终结果，在所述级联反应中，几种生化事件造成在损伤部位处的封闭或修复(Butenas和Mann 2002)。基于血液凝固级联的启动，已经将途径分成非固有的和固有的途径，其中所述非固有的途径通过组织因子(TF)的暴露而启动，而固有的途径由因子XII(Hageman因子)、高分子量激肽原(HK)或前激肽释放酶(prekalIikrain)启动。但是，2个级联途径最终汇合在因子Xa产生点，并随后跟随共同的凝血酶介导的纤维蛋白产生(Cannon和Tracy 1995)。凝血酶产生是 脊椎动物中的血液凝固过程的中枢步骤。在凝血酶产生过程中，少量凝血酶掺入扩大中的纤维蛋白凝块/网络中，并且该蛋白酶的催化部位(游离在被吸附的凝血酶中)能够放大凝块生长(Liu,Nossel等人.1979 ；Vali和Scheraga 1988)。凝血酶会与不同的底物相互作用，并活化几种凝块促进因子，例如(a)它通过切割它们的同源受体而造成血小板的活化，(b)造成因子V、VIII和XI的反馈活化，(c)造成转谷氨酰胺酶(transglutminase)、因子XIII的活化,和(d)将纤维蛋白原转化成纤维蛋白。在病理学状况下，在凝块形成并通过链间交联而稳定化以后，它会阻碍在血管中的正常血流，并导致动脉和静脉的堵塞。针对由动物/人类中的病理性血栓形成引起的循环病症(诸如心肌梗塞)的最常见的且优选的药物治疗之一是，血栓溶解剂的静脉内输注(Lijnen和Collen 1988 ；Collen和Lijnen 1990 ;Francis和Marder 1991)。可利用的溶血栓药诸如链激酶(SK)、尿激酶(UK)和组织纤溶酶原激活物(tPA)主要通过相同的纤溶酶依赖性的机理起作用(因为这些是纤溶酶原活化剂)，其中它们切割纤溶酶原的残基561和562之间的易切断肽，并将所述纤溶酶原转化成它的蛋白水解活化形式，即纤溶酶。组织纤溶酶原激活物和尿激酶是特异性地识别人纤溶酶原中的易切断肽键的蛋白酶(直接活化剂)，而链激酶和葡萄球菌激酶(它们是蛋白‘辅因子’，而不是蛋白酶，并因而是‘间接’活化剂；参见De Renzo, Boggiano等人.1967 ;Buck，Hummel等人.1968 ;McClintock和Bell 1971)首先与纤溶酶或纤溶酶原形成紧密的1:1复合物，并且得到的蛋白水解活性的复合物切割其它‘游离’纤溶酶原分子的易切断肽键，并指数地产生纤溶酶(WohI, Summaria等人.1978 ；Castellino和Powell1981 ；ffohl, Sinio 等人.1983 ；Davidson, Higgins 等人.1990 的综述)。在所有目前可得到的凝块破碎剂(也就是说，纤溶酶原活化剂蛋白药物)中，链激酶表现出最高的溶血栓能力，尽管由于(如SAK)细菌起源，它具有在少数患者中引起免疫反应的限制。尽管如此，因为它与tPA和UK相比相对较低的成本，它被广泛地用作提供得起的溶血栓药。成功的溶血栓治疗会帮助维持正常的血流,并改善大量患者的存活(Verstraete1990)，但是早期再闭塞或血栓重新形成(经常在相同部位)已经继续限制溶血栓药物的成功应用。几项研究证实，在多达30%的经过溶血栓治疗的患者中发生早期再闭塞(Ohman，Califf等人.1990)。通过增加血液的高凝性的纤溶酶活性，可以解释血栓重新形成或早期再闭塞的原因(Eisenberg, Miletich等人.1988);有人提出，纤溶酶活化接触因子(Ewald和Eisenberg 1995)、因子V (Lee和Mann 1989),还可能活化凝血酶原(Seitz等人，1993)。另一种提出的理由是，凝块结合的凝血酶随后分解出凝血酶，这又产生更多的凝血酶，而纤维蛋白结合的凝血酶相对地耐受抗_凝血酶抑制剂(Hogg和Jackson 1989 ；ffeitz, Hudoba等人.1990)； ‘释放的’凝血酶再局部地活化促凝活性，并开始活化血小板(Kumar，Beguin等人.1994 ；Puri,Kumar等人.1995),由此促进导致血栓重新形成的生化事件循环。因而，在损伤部位处的凝血酶抑制(二者直接地)和在它的促凝活性的‘二级’水平应当会极大地阻碍上述的不希望的事件链。如果这样的性质成功地掺入与溶血栓药物相同的分子中，在挽救生命方面的优点是显而易见的。纤溶酶原活化剂是特征性地催化纤溶酶原向纤溶酶的酶促转化的蛋白酶家族。TPA通过水解单个精氨酸-缬氨酸键而将纤溶酶原酶促转化为纤溶酶。 组织纤溶酶原激活物(也称作纤维蛋白激酶、非固有的纤溶酶原活化剂、t-PA或TPA)是一种糖蛋白，且具有约70，000道尔顿(68，000道尔顿)的近似分子量(MW)。它是通过水解单个精氨酸-缬氨酸键而催化前酶纤溶酶原的酶促转化成活性酶纤溶酶的丝氨酸蛋白酶。t-PA的催化部位由氨基酸His-322、Asp-371和Ser-478构成。在没有纤维蛋白存在下，t-PA是较差的纤溶酶原活化剂。氨基端区域由几个结构域构成，所述结构域与其它蛋白是同源的。这些独特的结构域参与该酶的几种功能，包括结合纤维蛋白、纤维蛋白-特异性的纤溶酶原活化、结合内皮细胞受体和快速的体内清除。包含氨基酸残基50-87的一个这样的结构域(E结构域)与人表皮生长因子是同源的，且似乎参与纤维蛋白结合、纤维蛋白亲和力和体内清除。克隆了 t-PAcDNA，并随后在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。组织纤溶酶原激活物(t-PA)是负责特异性地活化与纤维蛋白凝块相关的纤溶酶原(即能够溶解血块)的哺乳动物纤维蛋白溶解系统的组分。组织纤溶酶原激活物介导的凝块溶解显示出血浆中增加的纤维蛋白肽-A水平，所述纤维蛋白肽-A是凝块结合的凝血酶的直接标志物(Weitz, Leslie等人.1998)。组织纤溶酶原激活物和当前已知的抗-凝血酶药物(诸如肝素和水蛭素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.05 IN 1845/DEL/20101.嵌合蛋白构建体，其包含与溶血栓蛋白融合的血栓调节蛋白的4、5和6表皮生长因子样结构域(EGF4、5、6)，所述溶血栓蛋白选自由以下组成的组:链激酶、组织纤溶酶原激活物、葡萄球菌激酶、尿激酶和它们的衍生物和类似物。2.根据权利要求1所述的嵌合蛋白构建体，其中所述血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域与所述溶血栓蛋白或其衍生物或类似物在所述溶血栓蛋白或其衍生物或类似物的N-端、C-端或N和C两端处融合。3.根据权利要求1所述的嵌合蛋白构建体，其中所述溶血栓蛋白包含具有一个或多个氨基酸置换、插入、缺失或截短的链激酶，且其中所述构建体具有纤溶酶原活化、凝血酶抑制和抗凝蛋白C途径活化活性。4.根据权利要 求1所述的嵌合蛋白构建体，其中所述血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域融合在所述链激酶的α和β或β和Y结构域之间，或者融合在链激酶衍生物或类似物的α和β或β和Y结构域之间，其中所述链激酶衍生物或类似物包含一个或多个突变、添力口、插入或截短，且其中所述构建体活化纤溶酶原、抑制凝血酶和活化抗凝蛋白C途径。5.根据权利要求2所述的嵌合蛋白构建体，其中所述EGF4、5、6结构域与链激酶或链激酶衍生物或类似物在一个或多个位置处发生框架内融合，所述位置选自:链激酶N-端、链激酶C-端、N-和C-链激酶两端、或链激酶的结构域间位置。6.根据权利要求5所述的嵌合蛋白构建体，其中所述链激酶衍生物跨残基5-383或5-414。7.根据权利要求6所述的嵌合蛋白构建体，其中所述链激酶衍生物跨残基16-383。8.根据权利要求2所述的嵌合蛋白构建体，其中所述EGF4、5、6结构域在一个或多个选自链激酶N-端、链激酶C-端或N-和C-链激酶两端的位置处发生框架内融合，其中所述EGF4、5、6结构域的Met 41被缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代；或C-端Met 435被缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代；或在同时的N-和C-端融合构建体中，Met 41和Met 435独立地被缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代。9.根据权利要求1所述的嵌合蛋白构建体，其另外包含转谷氨酰胺酶识别序列。10.根据权利要求1所述的嵌合蛋白构建体，其另外包含在EGF4、5、6结构域与溶血栓蛋白或其衍生物或类似物的接点处的一个或多个凝血酶可切割序列。11.治疗哺乳动物的血栓形成的方法，所述方法包括:给需要治疗的所述哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求1-10中的任一项所述的嵌合蛋白构建体。12.嵌合蛋白构建体，其包含血栓调节蛋白的EGF4、5、6结构域，所述结构域与组织纤溶酶原激活物(tPA)衍生物、类似物或片段在下述位置处融合:在tPA衍生物、类似物或片段的N-端处，在tPA衍生物、类似物或片段的C-端处，在tPA衍生物、类似物或片段的两端处，或在tPA衍生物、类似物或片段内部。13.根据权利要求12所述的嵌合蛋白构建体，其中EGF4、5、6结构域和tPA衍生物、类似物或片段之间的融合体另外包含一个或多个接头片段。14.根据权利要求13所述的嵌合蛋白构建体，其中所述一个或多个接头片段包含一个或多个促进所述构建体的柔性的氨基酸。15.根据权利要求12所述的嵌合蛋白构建体，其中所述tPA衍生物、类似物或片段包含一个或多个突变、添加、插入或截短，且其中所述tPA衍生物、类似物或片段活化纤溶酶原、抑制凝血酶和活化抗凝蛋白C。16.根据权利要求12所述的嵌合蛋白构建体，其包含与一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域融合的组织纤溶酶原激活物(tPA)的片段或其截短或修饰形式，使得tPA的EGF结构域被一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域替代，且其中所述构建体具有抗凝血酶和纤溶酶原活化活性。17.根据权利要求12所述的嵌合蛋白构建体，其包含与一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域融合的组织纤溶酶原激活物(tPA)的片段或其截短或修饰形式，使得tPA的三环域...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼拉·马赫什瓦里，吉里什·萨尼，
申请(专利权)人：科学与工业研究委员会，
类型：
国别省市：