一种用于检测免疫不育相关自身抗体的新型抗原，该发明专利技术属生殖免疫学免疫不孕领域。目前，免疫不育者的实验室诊断主要是针对抗精子抗体。然而，精子抗原是一种复合性抗原，其中的大部分与不育无关。精子特异性乳酸脱氢酶是与不育有密切关系的精子抗原的一种。本研究利用分子克隆的方法构建了人精子特异性乳酸脱氢酶重组载体，将此载体转化E.coliBL21后在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导下，此转化菌可高效表达rhLDHC4蛋白，纯化后以此蛋白建立了人血清抗LDH-C4抗体（IgG型）检测的间接ELISA方法。实验结果表明：用此方法检测已育者血清和不明原因不育者血清。两者阳性率差别具有显著统计学意义。
【技术实现步骤摘要】
生殖免疫学包括生殖道粘膜免疫调节、生育免疫调节、母一胎免疫调节以及生殖内分泌一免疫调节4个方面。生殖免疫学认为人类的生殖腺与生殖细胞及其产生的激素都具有抗原性，可导致免疫反应，产生自身抗体，影响生殖过程的各个环节。正常人血清中有多种自身抗体，但其效价很低，不足以引起破坏作用，故称之为“生理性抗体”;但当其效价明显升高后，即引起自身免疫性疾病。1900年，Meichnikoff发现精子具有抗原性并能诱导特异性免疫应答的产生。1954年Wilson和Rumke首先在男性不育患者血清中发现了抗精子抗体(antisperm antibody, AsAb) 1994年Marshburn等通过众多研究提出:血清和生殖道内的AsAb可影响人类的生育能力。有研究指出:由AsAb引起的不育占总体不育者的10%-30%。然而精子抗原是一种复合性抗原，并非所有的抗精子抗体都与不育有关，只有那些针对在受精过程中起关键作用的精子靶抗原的抗精子抗体才有可能影响生育。精子上的与生育无关的无效抗原，可能会降低检测敏感性及特异性，给病人的治疗带来不必要的麻烦。因此，分离纯化精子特异性靶抗原作为包被抗原，是建立准确的检测影响生育的抗精子抗体的方法。
技术介绍
免疫性不育，在临床上通常是指排除器质性病变之外的“不明原因不育”的病因之一，对于免疫性不育的实验室诊断，目前主要是针对抗精子抗体进行测定。采用的技术包括传统抗原抗体反应、补体结合试验、免疫荧光、免疫珠、酶联免疫吸附法、混合抗球蛋白反应等，检测的临床标本包括血清、宫颈粘液、精浆等。然而，人类精子抗原相当复杂，约有100多种，按其特异性分为精子特异性抗原和精子非特异性抗原。它们所诱导产生的抗精子抗体对生育的影响力不尽相同。精子特异性乳酸脱氢酶(sperm-specific lactatedehydrogenase, LDH-C4)特异地存在于鸟类和哺乳动物的睾丸和精子中，可催化丙酮酸和乳酸的转化，为精子的运动和存活提供能量，雌性动物和雄性动物的免疫系统均可将其识别为异已成份，作为自身抗原、异型抗原或同种异型抗原，诱导机体产生免疫应答反应。将纯化的LDHC4 蛋白、经化学修饰的LDHC4多肽或构建的LDHC4-DNA疫苗免疫实验动物，在动物的血清或生殖道分泌液中均可检测到特异性抗体的存在，且动物的生育率明显降低，说明LDHC4抗体可能是抗精子抗体中与生殖密切有关的一种抗体。
技术实现思路
(一)目的 原核表达并纯化制备重组人精子特异性乳酸脱氢酶(rhLDH-C4)抗原，并以此抗原为包被抗原，建立人血清抗LDH-C4抗体(IgG型)检测的间接ELISA方法，为更准确的检测免疫性不育患者体内的自身抗体建立一种可靠的方法。并探讨人血清抗LDH-C4抗体与不育症的具体关系。(二)技术路线I pET-28 (a+) -hLDHC重组载体的构建及鉴定 目的片段的扩增及回收:依据GenBank登录的人LDH-C mRNA (G1: 187065)全长序列，采用OMIGA软件，自行设计针对人LDH-C全长编码序列两端的引物，并委托上海博亚公司合成。Pl (上游引物):5' -CCGAAGCTTGCACCAT GTCAACTGTCAAGGAGCAGC-3;，带一个Hind III酶切位点(划线处)。P2 (下游引物)序列为 5' -CCGCTCGAGTTAAAATATTAGATCCTTT- TGAATATTCC-3;带一个Xhol I酶切位点(划线处)。以人睾丸λ TripEx cDNA文库为模板，进行编码序列的PCR扩增反应总体积为50μ1。体系如下:10 X PCR缓冲液5μ1，dNTP混合液4Pl，cDNA模板Iμ ，上下游引物各141，了&9聚合酶(5~卜1)0.5卜1，ddH20 37.5μ1。混匀后，94°C预变性4分30秒，按下列参数:94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 2min，扩增。共30个循环。最后一个循环结束后继续在72°C延伸6min。产物在2.0%琼脂糖凝胶中电泳，切割含预期区带的凝胶块，上海华舜公司DNA凝胶回收试剂盒回收DNA。具体方法如下:将切下的凝胶块，放入eppendorf管中，每IOOmg凝胶块加入300μ1 SI缓冲液,置50°C水浴IOmin使胶溶解；将溶液移入吸附柱，13000r/min离心30s ;弃离心液，加入500μ1洗涤缓冲液Wl, 13000r/min离心15sec。重复此步骤一次；13000r/min离心Imin后,将吸附柱放入一新的1.5ml eppendorf管中，加入30μ1超纯水，室温静置Imin后，13000r/min离心2min,收集管中离心液。重组载体的构建:将回收的PCR产物按如下体系进行限制性内切酶酶切:10X酶切缓冲液 5Pl，PCR 回收产物(7lPg /πι1)25μ1,Η η(1 IIK 10υ/μ1) μ1，Χ1ιο1 I (10υ/μ1) μ1,ddH20 18μ1。将原核表达载体(pET_28a质粒)按如下体系进行限制性内切酶酶切:10Χ酶切缓冲液5μl，pET-28a质粒(265μg/ml)10μl，Hind IIK 10υ/μ1)2μ1, Xhol I (10υ/μ1)2μ1,ddH20 3 μ1。将上述反应 体系分别混匀后，37°C水浴箱中反应3h。酶切后产物与酶切前产物同时做DNA凝胶电泳，判断酶切是否完全。在紫外灯下用刀片切下含预期区带的凝胶块，用上海华舜公司DNA凝胶回收试剂盒从中回收DNA。具体方法同前。将回收后的双酶切的PCR产物和pET-28a质粒按如下体系进行连接:10X连接缓冲液Wl，pET_28a质粒(38μ8 /ml)2μ1，PCR 产物(36Pg /ml) 3μ1, T4 DNA 连接酶 0.5μ1，ddH20 3.5μ1。反应总体积为 10μ1,16°C过夜。表达菌及克隆菌的制备和鉴定:用CaC12处理法，制备E.coliBL21(DE3) plysS感受态细胞作为表达菌，具体步骤如下:(1)无菌条件下从37°C培养的新鲜E.coliBL21(DE3)plysS平板中挑取单个菌落接种于3ml不含抗生素的LB液体培养基中，37°C摇床摇菌过夜。(2)将0.1mol/L CaC12和1.5ml印pendorf管放在冰浴盒内冰浴。(3)取上述过夜菌液30μ1接种于3ml不含抗生素的LB液体培养基中，37°C摇床上剧烈振摇2h。(4)将菌液移至冰预冷的1.5ml eppendorf管中，置冰浴盒内冰浴5 min。(5)在4°C条件下，13000r/min离心30s。(6)弃上清，加入冰预冷的500μ1 0.lmol/L CaCl2轻轻重悬菌液，使其成均勻混悬状，置冰浴盒内冰浴5 min。(7)在4°C条件下，13000r/min离心30s。(8)弃上清，加入冰预冷的200μ1 0.lmol/L CaC12轻轻重悬菌液，4°C放置24 h。(9)取出上述感受态细胞，加入10μ1连接产物，轻轻混悬菌液，置冰浴盒内冰浴30 min。( 10) 42°C水浴热休克90 s (其间不要摇动EP管，休克时间一定要准确)，快速将EP管放入冰浴盒内冰浴5min，使本文档来自技高网...
【技术保护点】
本研究将从人睾丸λTripEx?cDNA文库中克隆的人精子特异性乳酸脱氢酶（sperm?specific?lactate?dehydrogenases,?LDH?C4）与高效原核表达载体pET?28a(+)连接，构建了pET?28(a+)?hLDHC重组质粒，将此质粒转化入大肠杆菌Ecol.BL21（DE3）plysS溶原菌中表达，在0.1mM?IPTG诱导下可高效表达可溶性的rhLDH?C4蛋白，经Ni+?NTA亲和层析法纯化并用透析带浓缩后，浓度可达1.0mg/ml，1000ml菌液共可获得目的蛋白约1.5mg；以此纯化蛋白作为包被抗原建立人血清抗LDH?C4抗体（IgG型）检测的间接ELISA方法，为准确的检测不育患者体内的自身抗体（LDH?C4抗体）提供一种可靠的临床参考指标；故要求如下：（1）pET?28(a+)?hLDHC原核重组载体的保存及使用。
【技术特征摘要】
1.本研究将从人睾丸XTripExCDNA文库中克隆的人精子特异性乳酸脱氢酶(sperm-specific lactate dehydrogenases, LDH-C4)与高效原核表达载体pET_28a(+)连接，构建了 pET-28 (a+) -hLDHC重组质粒，将此质粒转化入大肠杆菌Ecol.BL21 (DE3)plysS溶原菌中表达，在0.1mM IPTG诱导下可高效表达可溶性的rhLDH-C4蛋白，经Ni+-NTA亲和层析法纯化并用透析带浓缩后，浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：兰风华，
申请(专利权)人：兰风华，
类型：发明
国别省市：
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