本发明专利技术的目的是提供一种辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的试剂及其应用。本发明专利技术提供的试剂包括由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的特异引物。所述试剂还可包括核苷酸序列如序列表的序列4所示的特异探针。菜豆荚斑驳病毒是我国重要的检疫性有害生物，本发明专利技术中利用三条巢式PCR引物和一条TaqMan探针，建立了半巢式-RT-Realtime?PCR检测PBMV的方法。该方法有机地结合了巢式PCR和实时荧光PCR技术；三条引物和一条探针形成的两套PCR体系相互验证，有效提高了结果的准确性；实时荧光PCR技术有效提高了检测的灵敏度。本方法准确、灵敏、简便、快速，检出低限均可达0.5fg/μl植物总RNA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的试剂及其应用。
技术介绍
菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus, BPMV),属于5[豆花叶病毒属(Comvirus)成员。1948年在Zaumeyer和Thomas首次报道,现已在美国、加拿大、巴西、秘鲁、厄瓜多尔有分布，主要发生于美国东部和南部的大豆产区，并已向美国北部扩展蔓延。该病毒在中国无报道，是我国进境重要的检疫性病毒种类之一。BPMV寄主范围为豆科，主要是菜豆和大豆。该病毒在菜豆生长期、花期、结荚期以及收获后均可造成危害，主要症状是叶片出现黄色斑纹或者畸形，菜豆结荚数变少，豆粒的体积、重量和数量也都降低，从而造成菜豆产量大幅下降，同时种皮出现斑纹，种脐变色，严重降低莱豆的品质。该病毒单独侵染大豆，可造成3-52.4%减产，若与大豆花叶病毒及拟茎点霉属真菌复合侵染，产量损失可达60%以上。该病毒的传播介体主要是甲虫，保毒期2 7天可种传，但种传率低，仅为0.1%。BPMV的自然寄主在我国有较大面积种植，若BPMV随进口大豆传人我国并传播，将会对我国的大豆生产造成不可估量的损失。鉴于此，开发先进的检测技术，防止菜豆荚斑驳病毒传入我国具有重要意 义。目前，检测菜豆荚斑驳病毒国内外主要以免疫电镜技术、酶联免疫吸附测定(ELISA)和RT-PCR凝胶电泳技术为主，也有采用实时荧光PCR的研究报道，如RT-PCR凝胶电泳方法(韩芳，张颖滨，吴祖建等，菜豆荚斑驳病毒的RT-PCR检测及其传毒介体研究，西北农业学报[J]，2008，17 (5):94-97.) ;RT_LAMP技术(闻伟刚，杨翠云，崔俊霞等，RT-LAMP技术检测菜豆荚斑驳病毒的研究，植物保护[J]，2010，36 (6):139-141.);实时荧光RT-PCR方法(易汪雪，陈舜胜，杨翠云等，单管实时荧光PCR方法同进检测大豆种子中菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒，植物病理学报[J]，2011，41 (I):85-92.)。电镜技术设备昂贵，检测灵敏度低；ELISA技术操作步骤繁琐、检测周期长、灵敏度低、易出现假阳性。PCR凝胶电泳技术较ELISA在多个方面有所提高，但易于造成污染。未见采用半巢式-RT-Realtime PCR检测BPMV的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的试剂及其应用。本专利技术提供的辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成。所述试剂可由所述特异引物和特异探针组成；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列4所示。所述特异探针可为TaqMan探针。所述试剂可用于制备辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的试剂盒。本专利技术还保护一种辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的试剂盒，包括所述试剂。所述试剂可用于辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒。本专利技术还保护一种辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对甲进行PCR，得到PCR产物甲；以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对乙进行PCR，得到PCR产物乙；如果PCR产物甲为188bp且PCR产物乙为87bp，待测病毒为候选的菜豆荚斑驳病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对。本专利技术还保护另一种辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测病毒是否为候选的菜豆荚斑驳病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增曲线乙均为阳性，待测病毒为候选的菜豆荚斑驳病毒。所述待测病毒具体可为菜豆荚斑驳病毒、南方菜豆花叶病毒、花生矮化病毒、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒或番茄斑萎病毒。 本专利技术还保护一种检测待测样本中是否含有菜豆荚斑驳病毒的方法，包括如下步骤:(I)提取待测样本的总RNA，反转录为cDNA ；(2)以所述cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以所述cDNA为模板，用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测样本中是否含有菜豆荚斑驳病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增曲线乙均为阳性，待测样本含有菜豆荚斑驳病毒。所述TaqMan探针5’末端具体可连接有荧光报告染料FAM，3’末端具体可连接有荧光淬灭染料TAMRA。不同的方法，灵敏度和准确性差异较大，如ELISA与PCR凝胶电泳方法灵敏度相差100倍以上，PCR凝胶电泳与实时荧光PCR技术灵敏度相差也在100倍以上。即使同样采用实时荧光PCR技术，由于引物的扩增效率不一样，灵敏度差异也可达到1000倍以上。在实际检测鉴定工作中，为了提高结果的准确性，经常需要对一个结果进行两个以上的确认试验，不同方法检测灵敏度不一样，很难保证两个试验的结果完全一样，这就为结果的判断增加了难度，特别是在检测目标含量极少的情况下，这种难度就会进一步加大。若两套方法检测灵敏度一样或非常接近，这个难题就迎刃而解。实时荧光PCR (Realtime-PCR)检测技术是国际最近十余年发展起来的高新检测技术，该技术将PCR扩增与荧光检测系统有机结合起来。与目前已报道的其它检测技术相t匕，该技术具有巨大的优越性，主要体现在:(a)能实时观察PCR过程中待检测样品模板DNA(或cDNA)扩增情况，无需进行电泳、染色和紫外检测，大大简化了操作程序并缩短检测时间；(b)采用荧光信号放大功能，大大提高了灵敏度；(C)特异性引物与特异荧光探针双保险结构有效提高了检测的准确性；(d)全封闭的操作系统，减少了 PCR产物对实验室环境的染污和样品间的交叉染污，有效降低和避免了假阳性结果。实时荧光PCR技术，是目前生物检测领域中最准确、最灵敏的技术，其优越性使之在植物检疫中具有广阔的应用范围和前菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus，BPMV)是我国重要的检疫性有害生物。本研究根据BPMV中多聚蛋白基因(polyprotein gene)的保守序列,设计了三条巢式PCR引物和一条TaqMan探针，建立了半巢式-RT-Realtime PCR检测PBMV的方法。与现有技术比较，本专利技术的优点如下:⑴上述实时荧光PCR技术的优点在本专利技术得以全部体现，如准确、灵敏、简便、快速和能有效减少污染等；(2)设计上非常巧妙地将巢式PCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成。
【技术特征摘要】
1.一种辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成。2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于:所述试剂由所述特异引物和特异探针组成；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列4所示。3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于:所述特异探针为TaqMan探针。4.权利要求1至3中任一所述的试剂在制备辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的试剂盒中的应用。5.一种辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的试剂盒，包括权利要求1至3中任一所述的试剂。6.权利要求1至3中任一所述的试剂在辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒中的应用。7.一种辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对甲进行PCR，得到PCR产物甲；以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对乙进行PCR，得到PCR产物乙；如果PCR产物甲为188bp且PCR产物乙为87bp，待测病毒为候选的菜豆荚斑驳病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对。8.一种辅助鉴定菜豆荚斑驳病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得...
【专利技术属性】
技术研发人员：粟智平，钟响，张静，王颖，鲁闽，杨益娥，耿金培，
申请(专利权)人：粟智平，
类型：发明
国别省市：
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