本发明专利技术公开了一种快速鉴定1型登革热病毒的引物组、试剂盒及方法。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶、逆转录酶、对照和显色剂。其检测方法是通过提取待检病毒RNA，利用逆转录酶的逆转录活性，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品RNA模板进行扩增，加入显色剂观察反应管内的颜色变化来判断扩增与否。本发明专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病原微生物的检测与鉴定，具体涉及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速鉴定I型登革热病毒的方法。
技术介绍
登革热病毒(Dengue virus, DV)是一种黄病毒类RNA病毒，主要包括I 4型病毒(DV I 4)。登革热病毒主要通过埃及伊蚊Meofes和白纹伊蚊Meofesalbopictus)传播，登革热病毒的感染可以引起登革热(dengue fever, DF),严重的还可导致登革出血热(Dengue hemorrhagic fever, DHF)或登革休克综合征(Dengueshocksyndrome, DSS)等。DV广泛流行于全球的热带和亚热带地区,我国主要分布于广东、海南、广西、福建、台湾等省(自治区)。自1978年广东省佛山市暴发登革热以来，我国南方部分省区该病流行不断，200 6年广东省又发生了 DVl的流行，寻找一个合适的DVl鉴定方法可以为临床治疗提供很好的基础。目前登革热病毒的鉴定方法主要为PCR，ELISA、免疫胶体金等方法。登革热检测常用的ELISA、免疫胶体金方法耗时长，通常需要5 7 d血清中才能达到抗体能够检测水平，同时登革热抗体与其他黄病毒存在交叉反应，出现假阳性率较高，故血清学检测作为登革热病毒检测局限性较大；DV的分离可以很好的鉴定登革热病毒，但同样耗时长，敏感度又很低，也不可以作为早期检测登革热病毒的手段。近10多年发展起来的DV核酸检测技术，为登革热的早期诊断提供了可能，但PCR以及RT-PCR都需要昂贵的PCR仪作为基础，也在一定程度上限制了 PCR方法在鉴定登革热病毒上的发展。以上各种方法虽然可能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、灵敏度低、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。环介导等温基因扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,以下简称LAMP法)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将LAMP法应用于快速鉴定I型登革热病毒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一组用于快速I型登革热病毒的特异性引物，及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速鉴定I型登革热病毒的方法。本鉴定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下: 用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP特异性引物组，其特征在于，包括:内引物 1:5，_ CATCCTGTCTGAAGCATTGGCTGGACAATTGACATGGAATGATC-3，(SEQ ID N0.1)；内引物 2:5，- CCTAGCTCTGATGGCCACTTTCTTCTCTAGATGTTAGTCTGCG -3，(SEQ ID N0.2)；外引物 1:5’ - TGTGTTCCTCCTTCTCATAATG -3，(SEQ ID N0.3)；外引物 2:5’-CAGACTCAATCCAATCGTAAGA-3’ (SEQ ID N0.4)。环引物1:5，- CCAACCATGATGCATAACCTG-3’ (SEQ ID N0.5)环引物 2:5，- ATGAGACCAATGTTCGCTGT-3’ (SEQ ID N0.6) 一种用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其含有上述的RT-LAMP特异性引物组。优选的，所述用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，包括以下成分:(1)上述RT-LAMP特异性引物组；(2)逆转录酶；(3) DNA聚合酶；(4) RT-LAMP反应液；(5)显色剂；(6)阳性对照和阴性对照。所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6 8:1:3 4。所述逆转录酶为逆转录酶；所述DNA聚合酶为DNA聚合酶。所述RT-LAMP 反应液含有:10mM dNTPUO X ThermoPol 反应缓冲液、150mM MgSO4,5mM甜菜喊，四者的体积比为6 8:4 5:2 3:8 10。所述显示剂为SYBR GREEN I。所述阳性对照为含有I型登革热病毒NSl基因片段(SEQ ID N0.7)的质粒，阴性对照为DEPC水。一种快速鉴定登革热病毒I型的方法，具体包括如下步骤: (1)提取模板RNA； (2)环介导等温基因扩增反应:25μ I反应体系含有:内引物1、2各7 9pmol/^L，夕卜引物1、2各I 2 pmol/^L，环引物1、2各3 5 pmol/^L，反应液12 13μ ，DNA聚合酶7 9U，待检RNA f lOOng，逆转录酶I 2U，用灭菌去离子水补齐到25μ ，然后加入18 22μ 的密封液，将上述反应管于6(T65°C反应6(T90min ； (3)结果判断:在上述反应管中加入1_2μ 显色剂10XSYBRGREEN I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为登革热I型病毒，橙色则为非登革热I型病毒。优选的，环介导等温基因扩增反应的25 μ I反应体系含有:内引物1、2各Spmol/KL，外引物1、2各I pmol/^L，环引物1、2各4 pmol/^L，反应液12.5μ ，DNA聚合酶8U，待检RNA l 100ng，逆转录酶1U，用灭菌去离子水补齐到25μ 。本专利技术的有益效果在于:本专利技术针对I型登革热病毒NSl区域特异性设计了 6条引物，与目的基因的6个区域结合，具有较高的特异性。本专利技术的试剂盒方便快捷，能在较短的时间内鉴别I型登革热病毒，且不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高；特异性好，适合现场检测。附图说明图1为本专利技术RT-LAMP试剂盒的阴性与阳性对照品的检测结果(一:阴性对照，+:阳性对照); 图2为本专利技术对登革热1型病毒以及对非登革热1型病毒的扩增结果(一:阴性样品，+:阳性样品，1:非1型登革热病毒样本，2:1型登革热病毒样品)； 图 3 为实施例 3 的特异性验证结果(1:DEPC，2:HSV，3:EBV，4:JEV，5:YFV，6:DENV1，7:DENV2,8:DENV3,9:DENV4)； 图4为实施例4的灵敏度实验结果(a:普通PCR扩增结果，b: Real-time PCR扩增结果，c:本专利技术RT-LAMP扩增的电泳结果，d:本专利技术RT-LAMP扩增的Real-time结果，e:本专利技术RT-LAMP扩增的显色结果:1:DEPC，2 7:含有登革热病毒NSl基因1.0,1.0XlO1,1.0X102、1.0X103、1.0X104、1.0XlO5 拷贝 /μ L0)具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒的建立 用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，包括以下成分:(I)特异性引物组；(2)逆转录酶;(3) DNA聚合酶；(4) RT-LAMP反应液；(5)显色剂；(6)阳性对照和阴性对照。(1)特异性引物的设计: 根据I型登革热病毒(GenBank登录号为:EU848545.1) NSl区域的的特异性设计6条特异性引物，序列分别如下:内引物 1:5，_ CATCCTGTCTGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于快速鉴定1型登革热病毒的RT?LAMP特异性引物组，其特征在于，包括：内引物1：5’??CATCCTGTCTGAAGCATTGGCTGGACAATTGACATGGAATGATC?3’（SEQ?ID?No.1）；内引物2：5’??CCTAGCTCTGATGGCCACTTTCTTCTCTAGATGTTAGTCTGCG??3’（SEQ?ID?No.2）；外引物1：5’??TGTGTTCCTCCTTCTCATAATG??3’（SEQ?ID?No.3）；外引物2：5’?CAGACTCAATCCAATCGTAAGA?3’（SEQ?ID?No.4）。
【技术特征摘要】
1.用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP特异性引物组，其特征在于，包括:内引物 1:5，_ CATCCTGTCTGAAGCATTGGCTGGACAATTGACATGGAATGATC-3，(SEQ ID N0.1)；内引物 2:5，- CCTAGCTCTGATGGCCACTTTCTTCTCTAGATGTTAGTCTGCG -3，(SEQ ID N0.2)；外引物 1:5’ - TGTGTTCCTCCTTCTCATAATG -3，(SEQ ID N0.3)；外引物 2:5’-CAGACTCAATCCAATCGTAAGA-3’ (SEQ ID N0.4)。2.环引物1:5，- CCAACCATGATGCATAACCTG-3’ (SEQ ID N0.5)环引物 2:5，- ATGAGACCAATGTTCGCTGT-3’ (SEQ ID N0.6) 一种用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述 的用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包括以下成分:(I)权利要求1所述的引物组；(2)逆转录酶；(3) DNA聚合酶；(4)RT-LAMP反应液；(5)显色剂；(6)阳性对照和阴性对照。4.根据权利要求3所述的用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6 8:1:3 4。5.根据权利要求3所述的用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶为逆转录酶；所述DNA聚合酶为DNA聚合酶。6.根据权利要求3所述的用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述 RT-LAMP 反应...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄曦，胡胜锋，李淼，钟兰兰，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：
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