本申请公开了一种转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测引物及检测方法，该引物具有较强的特异性，能够用于PCR，并特异性的扩增出转基因油菜RF2品系的DNA片段，并且其扩增产物能够适合于后续的DHPLC分析。该检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、特异性强的转基因油菜RF2品系的检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本申请的引物和检测方法为转基因油菜RF2品系的检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫等部门使用。
【技术实现步骤摘要】
本申请涉及转基因产品的检测，特别是涉及一种转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测弓I物及检测方法。
技术介绍
目前对转基因油菜的检测方法主要采用常规PCR，实时荧光PCR、PCR_基因芯片等检测方法。传统的常规PCR检测方法在平台扩展方面具有一定的局限性，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大；另一方面，通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法，区分效率不高，检测结果不理想。实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较多重常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展，并且检测成本高。常规的多套PCR-基因芯片检测方法，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。变性高效液相色谱技术(Denaturing High-performance Liquid Chromatography,DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，具有分辨率好、扩展性强、灵敏度高等优点。该方法在50°C条件分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定，样品的碱基对数量不同洗脱顺序也不同，从而产生不同的样品峰。具体的，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与DNA marker比较确定分子量大小，从而判定样品中是否含有目标检测基因。PCR-DHPLC，是将PCR与DHPLC相结合的技术，即先采用PCR扩增出靶标序列，然后再对扩增产物进行DHPLC分析，从而提高检测的灵敏度和特异性。目前，尚没有转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC的检测方法。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的用于转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测的引物，以及基于该引物的转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测方法。为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案:本申请公开了一种用于转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测的引物，该引物的上游引物含有Seq ID N0.1所示序列，下游引物含有Seq ID N0.2所示序列；Seq ID N0.1:5，-GCGAATTTGGCCGGTGAGT-3，Seq ID N0.2:5，-TCAACAACATCCATGGTGCCAT-3，。需要说明的是，本申请的引物是针对转基因油菜RF2品系而设计的特异性引物，能够对转基因油菜RF2品系进行特异性扩增，因此，可以理解，该引物除了用于本申请的PCR-DHPLC检测以外，同样适用于常规的PCR检测，以及其它的基于PCR扩增的检测，如实时荧光PCR、基因芯片等等。本申请的另一面还公开了一种转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测方法，该检测方法包括采用本申请设计的引物，以待检测样品的DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行变性高效液相色谱分析。需要说明的是，本申请设计的引物是针对转基因油菜RF2品系的特异性引物，因此，可以理解，如果待检测样品中含有足量的转基因油菜RF2品系成分，即可扩增出相应的靶标片段，并在DHPLC分析时产生相应的洗脱峰。进一步的,本申请的检测方法还包括以DNA marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与DNA marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。优选的本申请的检测方法包括如下步骤:(A)采用本申请的引物，以待检测样品的DNA为模板，进行PCR扩增；(B)以步骤(A)的PCR扩增产物为样品进行DHPLC分析，同时以DNAmarker为参考标准进行DHPLC分析；(C)将步骤(B)中PCR扩增产物的DHPLC分析结果与DNA marker的DHPLC分析结果进行比较，确定PCR扩增产物的 分子量大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。需要说明的是，理论上，本申请的引物是根据转基因油菜RF2品系设计的特异性引物，能够对待检测样品中的转基因油菜RF2品系成分扩增出约259bp的片段，因此，能够通过DHPLC分析出259bp的洗脱峰；而对其它成分不会有扩增，即不会有其它洗脱峰出现。本申请中，判断是否含有转基因油菜RF2品系的靶标序列的依据即，是否有259bp的洗脱峰。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于:本申请的转基因油菜RF2品系检测引物具有较强的特异性，能够用于后续的多重PCR扩增以及DHPLC分析。本申请针对传统的电泳分析PCR扩增结果不理想的问题，将PCR与DHPLC相结合，提供了一种操作简便、扩展性能好、分辨率高的转基因油菜RF2品系检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，对不同大小的PCR产物片段区分率可达数个碱基，甚至能够区分出I个碱基大小差异的片段。本申请的引物和检测方法为转基因油菜RF2品系的检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于Π岸检验检疫等部门使用。附图说明图1:是本申请实施例中PCR扩增产物的DHPLC分析的部分结果图；图2:是本申请实施例中PCR扩增产物的DHPLC分析的部分结果图；图3:是本申请实施例中PCR扩增产物的DHPLC分析的部分结果图；图1中自上而下的曲线分别代表M为DNA marker、W为水空白、al为转基因油菜品系MSl、bl为转基因油菜品系RFl、cl为转基因油菜品系RF2、dl为转基因油菜品系RF3、el为转基因油菜品系RT73、fl为转基因油菜品系MS8、gl为转基因油菜品系T45、hi为转基因油菜品系Topasl9/2、il为非转基因油菜、jl为转基因玉米品系3272、kl为转基因玉米品系59122，图2中自上而下的曲线分别代表a2为转基因玉米品系Btll、b2为转基因玉米品系Btl76、c2为转基因玉米品系GA21、d2为转基因玉米品系MIR604、e2为转基因玉米品系M0N810、f2为转基因玉米品系M0N863、g2为转基因玉米品系M0N88017、h2为转基因玉米品系M0N89034、 2为转基因玉米品系NK603、J2为转基因玉米品系TC1507、k2为转基因玉米品系T25、L2为非转基因玉米、m2为非转基因玉米，图3中自上而下的曲线分别代表a3为转基因大豆品系A2704-12、b3为转基因大豆品系A5547-127、c3为转基因大豆品系GTS40-3-2、d3为转基因大豆品系M0N89788、e3为非转基因大豆、f3为大豆盲样、g3为转基因棉花品系GHB614、h3为转基因棉花品系LLCotton25、i3为非转基因棉花、j3为转基因水稻品系LL Rice62、k3为非转基因水稻、L3为转基因马铃薯品系EH92-527_l、m3为木瓜。marker 的各峰值从左至右依次为 80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。具体实施例方式本申请提供了用于转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测的引物，该引物针对转基因油菜RF2品系的特异序列进行设计，能够用于转基因油菜RF2品系的特异性扩增检测。在此基础上本申请还提供了基于本申请的引物的转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测方法。需要说本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于转基因油菜RF2品系的PCR?DHPLC检测的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物含有Seq?ID?No.1所示序列，所述下游引物含有Seq?ID?No.2所示序列；Seq?ID?No.1：5’?GCGAATTTGGCCGGTGAGT?3’Seq?ID?No.2：5’?TCAACAACATCCATGGTGCCAT?3’。
【技术特征摘要】
1.一种用于转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测的引物，其特征在于:所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物含有Seq ID N0.1所示序列，所述下游引物含有SeqID N0.2所示序列；Seq ID N0.1:5’ -GCGAATTTGGCCGGTGAGT-3’Seq ID N0.2:5’ -TCAACAACATCCATGGTGCCAT-3’。2.—种转基因油菜RF2品系...
【专利技术属性】
技术研发人员：章桂明，向才玉，潘广，凌杏园，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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