本发明专利技术公开了一种鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-II及其高效表达海藻酸裂解酶ZH0-II的原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-II，该载体用Ptac启动子控制它在大肠杆菌中的表达，本发明专利技术将海藻酸裂解酶基因采用大肠杆菌表达载体进行表达，能够在较短时间内获得表达产物海藻酸裂解酶ZH0-II，且获得的重组海藻酸裂解酶ZH0-II具有广泛的底物特异性，既能利用PloyG又能利用PloyM为底物，酶活可以达到61.7U/mg，本发明专利技术的原核表达载体及整体表达系统容易操作，便于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因工程领域，具体涉及一种鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因及其高效表达鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶蛋白ZHO-1I的原核表达载体pGEX-4T-l-ZM -JJ及其在制备海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白中的应用。
技术介绍
近年来，由于能源危机的加剧，环境问题日益突出，以海藻生物质为原料生产生物能源越来越受到重视。大型海藻含有丰富碳水化合物，如海藻酸，开发相应的技术可将其转化为生物乙醇，产量高，且容易预处理。目前，海藻酸降解的方法可分为三大类:一类是化学降解法，目前广泛采用的是酸水解法，这种方法操作步骤繁琐，反应条件剧烈。此外，还有过氧化氢氧化降解法；第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸；第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，环境友好，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一或组合使用不同底物专一性的酶制剂。目前，海藻酸裂解酶的生产大多是依靠海藻酸分解菌。虽然野生型海藻酸分解菌能有效的获得一定量的酶蛋白，但产量很低成本较高，难达到实际应用要求。因此，利用基因工程手段对海藻酸裂解酶基因进行异源表达是提高海藻酸裂解酶产量的最有效途径。1993年,Boyd等首次克隆了Psoudomoims alginovora海藻酸裂解酶的编码基因algL并在大肠杆菌中进行了表达，其粗蛋白活性达到146U/mg。1996年Frederic PsGudomormsalginovora中编码海藻酸裂解酶的基因aly在大肠杆菌中表达，并且其催化活性达到97U/mgo 2009 年，Gaofei Vnxan 等在Pseudoalteromonassp.CY24 中克隆得到了海藻酸裂解酶基因alyPI，在大肠杆菌中表达得到一个58KD的蛋白，催化活性达到了 121.6U/mg。2012年,Hwan Hee Park等利用sp.MJ-3的基因组构建基因文库,筛选得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并将其在大肠杆菌中表达，得到了一种对PolyM和polyG都有活性的双功能酶。 目前，国内外所发现的海藻酸分解菌的种类众多，主要分布于海洋细菌、土壤细菌和真菌等，但被成功克隆及异源表达的海藻酸裂解酶并不多，传统方法一般利用海藻酸钠分解菌，通过发酵生产分离、纯化得到海藻酸裂解酶，这种方法存在野生菌产酶量低、酶与降解产物难于分离，生产成本高等问题，成为酶解技术大量制备褐藻胶低聚糖的制约性技术难题，限制了海藻酸裂解酶的推广使用，且大多数海藻酸裂解酶只能单一的利用PloyG或者PloyM，本专利技术从鞘氨醇单胞菌ZHO中成功克隆出海藻酸裂解酶基因并进行了异源表达和蛋白纯化的研究，本专利技术所获得的重组海藻酸裂解酶ZHO-1I具有广泛的底物特异性，既能利用PloyG又能利用PloyM为底物,是一种具有广阔运用前景的双功能酶,本专利技术为进一步研究海藻酸裂解酶分子机理，进而推广到工业生产奠定基础
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鞘氨醇单胞菌的海藻酸裂解酶基因ZHO-1I，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所不,该基因编码如SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白质。 本专利技术另一目的是提供一种鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因^% -//的原核表达载体，该载体含有海藻酸裂解酶基因ZM -/八Ptac启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS、GST标签，ZHO-1I基因的上游为Ptac启动子，Ptac启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠乃 -//基因的起始密码子上游的是一个GST标签序列，可生成易溶于水的融合表达蛋白，之后通过凝血酶可将GST标签切除而不影响目的蛋白的结构活性。本专利技术中所述海藻酸裂解酶基来源于鞘氨醇单胞菌sp.ZHO。本专利技术的另一目的是将鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因ZHO-1I的原核表达载体PGEX-4T-1-ZM -//应用在制备海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白中。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案: 1、鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶ZHO-1I基因的获得及原核表达载体的构建 (1)根据鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶N端和C端的保守序列和原核表达载体pGEX-4T-l多克隆酶切位点，设计如下I对特异引物:ZH0-2-F:5，-GGATCCGCACCGGCC GCAGCGCACTCGGCC-3，, ZH0-2-R:5’ -GCGGCCGCTCAGCTCGAGTGCTTTACGTGGAG-3’，在 h下游引物的 5’ 端分别加A BamH I和Not I酶切位点(下划线为酶切位点)；提取鞘氨醇单胞菌sp.ZHO的基因组，使用上述引物进行扩增，得到海藻酸裂解酶ZHO-1I的全长DNA序列； (2)回收并纯化海藻酸裂解酶ZHO-1I全长基因片段，并将其连接到Pmdl9-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD19-ZM -JJ ； (3)构建原核载体pGEX-4T-l-Z挪-JJ，用BamHI和Not I双酶切_19-ZH0_II和PGEX-4T-1，并回收纯化ZHO-1I基因片段以及载体片段PGEX-4T-1，然后连接、转化、抽提质粒进行单、双酶切检测，获得原核表达载体pGEX-4T-l-ZM -JJ，进行测序比对分析，将测序结果进行生物信息学分析。2、海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白的原核表达 使用热刺激法将PGEX-4T-1-Z挪-JJ转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，在终浓度ImM IPTG诱导下筛选最佳表达条件，并在最适条件下进行大量表达； 3、海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白纯化 收集菌体，进行超声破碎，过GST琼脂糖凝胶柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于ZHO-1I蛋白表达SDS-PAGE检测及下一阶段实验。4、海藻酸裂解酶ZHO-1I的特性研究 对纯化后的海藻酸裂解酶ZHO-1I进行特性研究，内容包括最适PH，最适温度，热稳定性等，本专利技术获得的重组海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白，其最适pH为6.5，最适温度为47°C，在50°C, IOmin损失50%的酶活性；本专利技术中使用的测定方法为常规的海藻酸裂解酶活性测定方法，测定反应底物在A235nm处吸光值的变化。本专利技术对海藻酸裂解酶基因进行了扩增，并进一步原核表达和蛋白纯化，获得的ZHO-1I蛋白，现有技术海藻酸裂解酶野生菌株通过发酵培养到产酶，至少需要3天时间，而本专利技术的基因工程菌株只需要6h即可得到最大量的目的蛋白，本专利技术所获得的重组海藻酸裂解酶ZHO-1I具有广泛的底物特异性，既能利用PloyG又能利用PloyM为底物，是一种具有广阔运用前景的双功能酶，本专利技术解决了现有的产海藻酸裂解酶的菌株的酶产量比较低的问题，也为进一步对裂解酶ZHO-1I进行机理及机制研究奠定了基础。附图说明图1为本专利技术鞘氨醇单胞菌ZHO基因组DNA的检测示意图；其中M是DNA marker ；I是基因组DNA ； 图2为本专利技术海藻酸裂解酶基因ZHO-1I的TA克隆策略示意图3为本专利技术TA克隆重组质粒mm-ZHO-1I的电泳检测及酶切检测示意图，其中:A图为质粒的电泳检测示意图，图中:MSDNA marker ; 1-2为pMD19-ZM -JJ;B图为重组质粒的酶切检测示本文档来自技高网...
【技术保护点】
鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0?II，其特征在于：海藻酸裂解酶基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其编码如SEQ?ID?NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因其特征在于:海藻酸裂解酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。2.权利要求1所述鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因的原核表达载体，其特征在于:该载体含有海藻酸裂解酶基因^% _//、Ptac启动子和终止子、细...
【专利技术属性】
技术研发人员：伊日布斯，过敏，钱龙，赵琳，唐丽薇，严金平，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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