本发明专利技术公开了一种经过密码子优化的点突变丙酰辅酶A转移酶基因及其应用。本发明专利技术所提供经过密码子优化的点突变丙酰辅酶A转移酶基因为如下a）-c）中任一DNA分子：a）编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；b）序列表中序列1所示的DNA分子；c）与序列表中序列1至少具有98%的同一性，且编码序列2所示蛋白质的DNA分子。实验证明，在大肠杆菌中，本发明专利技术所提供的经过密码子优化的丙酰辅酶A转移酶基因与优化前相比，可表达更高量的丙酰辅酶A转移酶，且其酶活并未因密码子优化而受到任何影响。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种经过密码子优化的点突变丙酰辅酶A转移酶基因及其应用，特别涉及一种根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化后的点突变丙酰辅酶A转移酶基因及其应用。
技术介绍
辅酶A转移酶可逆催化辅酶A转移反应，其将酯酰辅酶A的辅酶A部分转移到体系中的游离酸上。现阶段研究的辅酶A根据不同的反应机制分为三个家族，但都是辅酶A供体和游离的受体之间通过酶的转化过程。辅酶A转移酶可以催化乳酸转化为乳酰辅酶A，乳酰辅酶A是进一步生物合成聚 乳酸(PLA)和丙烯酸等重要中间产物，因此，辅酶A转移酶在工业上具有应用价值。乳酰辅酶A被发现是丙氨酸发酵通路中重要的中间产物，此通路在极少数的生物体中存在，其中包括丙酸梭菌(Clostridium propionicum),栖瘤胃拟杆菌(Bacteroidesruminicola)和同型丙酸梭菌(Clostridium homopropionicum)。丙酸辅酶A转移酶(propionyl-CoA transferase,Pct)可以催化丙酰辅酶A或者乙酰辅酶A作为辅酶A供体将D-乳酸转化为D-乳酰辅酶A。其结构是一个同源四聚体，每个亚基分子量约为67kDa，其对于D-乳酸比L-乳酸的亲和性更高。野生型的丙酰辅酶A转移酶在大肠杆菌宿主中并不能够过量表达，这就极大的限制了丙酰辅酶A转移酶的原核表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种经过密码子优化的点突变丙酰辅酶A转移酶基因及其应用。本专利技术所提供的经过密码子优化的点突变丙酰辅酶A转移酶基因，是先在不改变丙酸辅酶A转移酶(propionyl-CoA transferase, Pct)蛋白氨基酸序列(见GenBank:AJ276553.1)的前提下，将其野生型编码基因(序列3，GenBank:AJ276553.1的第485-2059位)的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，再根据相关文献报道(Taek HoYang, Tae Wan Kim, Hye 0k Kang, Sang-Hyun Lee, Eun Jeong Lee, Sung-Chul Lim, Sun0k Oh, Ae-Jin Song, Si Jae Park, Sang Yup Lee.Biosynthesis of polylactic acidand its copolymers using evolved propionate CoA transferase and PHA synthase.Biotechnology and Bioengineering, 2010, 105, 150-160.)，将对应于丙酸辅酶A转移酶蛋白氨基酸序列第193位Val的三个核苷酸改为大肠杆菌偏好(高频使用)的编码Ala的密码子，旨在减小蛋白表达过程中外源蛋白对宿主大肠杆菌的抑制作用。将优化后的该基因命名为Npct基因，具体为如下a) -c)中任一 DNA分子:a)编码序列为序列表中序列I所示的DNA分子；b)序列表中序列I所示的DNA分子；c)与序列表中序列I至少具有98%的同一性，且编码序列2所示蛋白质的DNA分子。其中，序列I共由1575个核苷酸组成，整个序列为⑶S序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质(即为点突变丙酰辅酶A转移酶)。序列3也共由1575个核苷酸组成，整个序列为CDS序列，其编码的蛋白质(丙酰辅酶A转移酶)的氨基酸序列为将序列表中序列2的第193位的Ala改为Val后的序列。序列2共由524个氨基酸组成。含有所述DNA分子(Npct基因)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因细胞进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可发光化合物的基因(GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)等。在本专利技术中，所述重组表达载体中启动所述DNA分子(Npct基因)转录的启动子具体为T7启动子。所述重组表达载体具体为将所述DNA分子(Npct基因)插入到质粒pET22b的多克隆位点处得到的重 组质粒。在本专利技术的一个实施例中，所述多克隆位点为Nde I和Xho I。由所述DNA分子(Npct基因)转录所得的RNA分子也属于本专利技术的保护范围。所述DNA分子，或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或所述RNA分子在辅酶A转移中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述DNA分子，或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或所述RNA分子，在存在辅酶A供体的前提下，将D-乳酸转化为D-乳酰辅酶A中的应用也属于本专利技术的保护范围。在上述应用，所述辅酶A供体可为丙酰辅酶A或/和乙酰辅酶A。在本专利技术的一个实施例中，所述辅酶A供体具体为乙酰辅酶A。所述DNA分子在提高大肠杆菌中丙酰辅酶A转移酶表达量中的应用也属于本专利技术的保护范围；所述丙酰辅酶A转移酶为序列表中序列2所示蛋白质。实验证明，在大肠杆菌中，本专利技术所提供的经过密码子优化的丙酰辅酶A转移酶基因(Npct基因)与优化前(序列3)相比，可表达更高量的丙酰辅酶A转移酶，且其酶活并未因密码子优化而受到影响。附图说明图1为重组表达载体pET22b_Npct的酶切图谱。其中，泳道M为DNA分子量标准；泳道I为未经酶切的质粒对照；泳道2为使用Nde I和Xho I双酶切的重组质粒。图2为经His标签蛋白纯化试剂盒纯化后的丙酰辅酶A转移酶蛋白，以及纯化后经脱盐柱脱盐后的蛋白进行SDS-PAGE电泳图。其中，泳道M为蛋白分子量标准；泳道I为经His标签蛋白纯化试剂盒纯化后的蛋白；泳道2为纯化后经脱盐柱脱盐后的蛋白。图3为纯化脱盐后的丙酰辅酶A转移酶作用乳酸和乙酰辅酶A后的HPLC检测图谱。其中，a)为对照组(不添加酶)，b)为实验组(添加酶)。图4为实验组在保留时间按略小于15min的位置上出现的产物峰(D_乳酰辅酶A)的质谱检测图。图5为优化前后丙酰辅酶A转移酶基因在大肠杆菌中蛋白表达量的测定结果。其中，泳道M为蛋白分子量标准；泳道I为优化前未经IPTG诱导的组I ;泳道2为优化前经IPTG诱导的组2 ;泳道3为优化后未经IPTG诱导的组3 ;泳道4为优化后经IPTG诱导的组4。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pET22b载体:Novagen公司产品，产品目录号为69744-3。在pET22b载体的Xho I识别位点后紧连着6个His的编码基因及终止密码子。乙酰辅酶A三锂盐:Sigma-Aldrich(St Louis, MO，USA)公司产品，产品本文档来自技高网...
【技术保护点】
DNA分子，为如下a）?c）中任一：a）编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；b）序列表中序列1所示的DNA分子；c）与序列表中序列1至少具有98%的同一性，且编码序列2所示蛋白质的DNA分子。
【技术特征摘要】
1.DNA分子，为如下a) -c)中任一: a)编码序列为序列表中序列I所示的DNA分子； b)序列表中序列I所不的DNA分子； c)与序列表中序列I至少具有98%的同一性，且编码序列2所示蛋白质的DNA分子。2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于:所述重组表达载体中启动所述DNA分子转录的启动子为T7启动子。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组表达载体为将所述DNA分子插入到质粒pET22b的多克隆位点处得到的重组质...
【专利技术属性】
技术研发人员：管祥辰，于波，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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