本发明专利技术公开了完整的猪Xist基因序列，并公开了提高猪克隆效率的方法。本发明专利技术利用生物信息学方法电子克隆猪Xist基因序列，并对序列进行验证分析，得到猪Xist基因序列。设计并合成anti-XistsiRNA序列，用分子生物学技术筛选出有效的anti-Xist?siRNA序列，用anti-Xist?siRNA抑制核移植重构胚或核移植供核细胞中Xist基因表达，来提高猪克隆胚胎发育的质量，以期达到提高猪克隆效率的目的。本技术首次获得完整的猪Xist序列及anti-Xist?siRNA序列，同时，此技术可提高猪克隆胚胎体外发育的质量，而猪克隆效率的提高无论是在畜牧生产领域、科研领域还是医学领域都将具有十分重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及转基因工程技术，具体涉及一种提高猪克隆效率的方法。
技术介绍
1938年,德国科学家Spemanm最早提出并进行细胞核移植实验,之后大量的科学家投入到核移植克隆动物的实验中来，直到1997年英国罗斯林研究所宣布克隆羊“多莉”成功培育，表明体细胞可作为供核细胞进行细胞核移植，为克隆技术的大力发展提供了理论依据，翻开了动物克隆史新的一页。随后大量的克隆动物陆续诞生，而于2000年成功获得了世界上首例用猪胎儿成纤维细胞作为供核细胞的体细胞核移植猪。现已获得的克隆动物有小鼠、绵羊、兔、猪、牛、猴、猫、大鼠、骡子、马、狗、雪貂等。这标志着哺乳动物的核移植克隆技术已日趋成熟。同时，动物克隆技术在农业、生物学和医药学等领域有十分广泛的用途。克隆技术可利用优良品种的体细胞作为核供体来克隆动物，可大大缩短育种年限，得到优质动物种群，加速动物育种进程；可利用克隆技术拯救濒危动物，保护珍稀物种、保护生物多样性。克隆技术与转基因技术相结合，对解决人类器官移植来源、改善动物品种、疾病治疗等有重要意义。而猪作为人类疾病治疗的模式生物，其克隆技术对解决人类异种器官移植尤为重要。但是，动物克隆技术仍面临一个重要难题，就是克隆效率低的问题。有研究报道，哺乳动物的克隆效率一般不超过3% (出生个体数/核移植重构胚数)，而猪的克隆效率更低为1-2%，这大大限制了动物克隆技术的研究与应用。提高动物克隆效率的研究较多，主要表现在核供体、核受体的选择 、供受体间的相互作用和核移植的操作方法等传统方法的研究，但是效果却并不明显，克隆成功率仍不超过3%。现有技术基本上是通过供核细胞和受体细胞的选择、供受体细胞间的相互关系及核移植的操作方法等方面来探索如何提高猪的克隆效率，这些技术一定程度上受地域、时间和个体因素差别的影响，因此可重复性差、效果不明显，不适用于大规模的制备克隆动物。Xist基因被认为是调控X染色体失活的关键基因，它启动X染色体的失活，在X染色体失活中心开始转录，转录产物通过包围整条X染色体使其沉默，从而实现哺乳动物的剂量补偿效应。而近年来发现Xist基因在克隆动物(或胚胎)中异常表达，推测其与克隆动物(或胚胎)的异常发育或死亡有关。但是目前在猪上，尚未报道有人做过类似的实验，且猪的Xist基因序列并未公布。
技术实现思路
本专利技术目的通过生物信息学方法获得了完整的猪Xist基因序列，为今后进一步研究猪X染色体失活机制及其对克隆动物的正常发育的影响提供了基础。本专利技术的另一目的是提供一种猪ant1-Xist siRNA序列。本专利技术的另一目的是提供一种提高猪克隆胚胎的发育质量、继而提高猪的克隆效率的方法，猪克隆效率的提高，可缩短育种年限，培育优良品种。本专利技术的上述目的是通过如下方案予以实现的:一种猪Xist基因序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO:1所述。一种猪ant1-Xist siRNA序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO:2和3所述。一种猪ant1-Xist siRNA序列,所述序列为如序列表SEQ ID NO: 4和5所述。一种猪ant1-Xist siRNA序列,所述序列为如序列表SEQ ID NO:6和7所述。一种猪ant1-Xist siRNA序列,所述序列为如序列表SEQ ID NO:8和9所述。一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法通过以下步骤实现:I)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；2)有效ant1-Xist siRNA序列的筛选:以母猪cDNA为模版，设计引物，进行定量PCR反应，筛选有效的ant1-Xist siRNA序列；3) ant1-Xi st siRNAl显微注射猪早期核移植胚胎；4) ant1-Xist-siRNAl转染核移植的供核细胞，用ant1-Xist siRNAl抑制克隆胚胎中Xist基因表达，提高体外培养猪克隆胚胎的囊胚内细胞数。本专利技术提供了另一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法为用ant1-Xist siRNA显微注射激活后猪的核移植重构胚，具体步骤如下:I)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；2)设计合成 ant1-Xist siRNA 序列；3)筛选出有效的 ant1-Xist siRNA ；4)制备猪的核移植重构胚，将有效的ant1-Xist siRNA序列显微注射到激活后的核移植重构胚中；5)将处理后的重构胚移植到代孕母猪体内，提高克隆效率。本专利技术提供了又一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法为用ant1-Xist siRNA直接转染核移植的供体细胞，具体步骤为:I)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；2)设计合成 ant1-Xist siRNA 序列；3)筛选出有效的 ant1-Xist siRNA ；4)用有效的siRNA转染核移植的供核细胞；5)用处理后的供核细胞制备克隆胚胎以期提高克隆效率。本专利技术还提供了一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法为直接敲除核移植的供体细胞中Xist基因，具体步骤为:I)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；2)设计同源重组打靶质粒制备敲除Xist序列的细胞系；3)用第2)步骤的细胞系作为核移植的供核细胞制备克隆猪，以提高克隆效率。本专利技术还提供另一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法为制备抗Xist基因的转基因猪，具体步骤为:I)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列； 2)设计合成 ant1-Xist siRNA 序列；3)筛选出有效的 ant1-Xist siRNA ；4)用有效的 ant1-Xist siRNA 构建 ant1-Xist shRNA 质粒；5)用ant1-Xist shRNA质粒制备转基因细胞系；6)用第5)步骤的细胞系作为核移植的供核细胞制备克隆猪，以提高克隆效率。本专利技术首次获得完整的猪Xist序列及ant1-Xist siRNA序列，为今后研究猪X染色体失活机理，及研究Xist基因表达与猪克隆胚胎发育的关系提供了基础。同时，此技术可提闻猪克隆胚胎体外发育 的质量，为提闻猪克隆效率的进一步研究提供了理论依据。而猪克隆效率的提高无论是在畜牧生产领域、科本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪Xist基因序列，其特征在于，所述序列为如序列表SEQID?NO：1所述。
【技术特征摘要】
1.一种猪XiSt基因序列，其特征在于，所述序列为如序列表SEQID NO:1所述。2.一种猪ant1-Xist siRNA序列，其特征在于，所述序列为如序列表SEQ ID N0:2和3所述。3.一种猪ant1-Xist siRNA序列，其特征在于，所述序列为如序列表SEQ ID N0:4和5所述。4.一种猪ant1-Xist siRNA序列，其特征在于，所述序列为如序列表SEQ ID N0:6和7所述。5.一种猪ant1-Xist siRNA序列,其特征在于,所述序列为如序列表SEQ ID NO:8和9所述。6.一种通过抑制如权利要求1所述基因表达来提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述方法通过以下步 骤实现: 1)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列； 2)有效ant1-XistsiRNA序列的筛选:以母猪cDNA为模版，设计引物，进行定量PCR反应，筛选有效的ant1-Xist siRNA序列； 3)ant1-Xist siRNAl显微注射猪早期核移植胚胎； 4)ant1-Xist-siRNAl转染核移植的供核细胞，用ant1-Xist siRNAl抑制克隆胚胎中Xist基因表达，提高体外培养猪克隆胚胎的囊胚内细胞数。7.—种通过抑制如权利要求1所述基因表达来提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述方法为用ant1-Xist siRNA显微注射激活后猪的核移植重构胚，具体步骤如下: 1)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列； 2)设计合成ant1-XistsiRNA序列； 3)筛选出有效的ant1-XistsiRNA ； 4)制备猪的核移植重构胚，将有效的ant1-XistsiRNA序列显微注射到激活后的核移植重构胚中...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄志华，刘德武，李紫聪，袁玉娟，吴珍芳，
申请(专利权)人：吴珍芳，李紫聪，
类型：发明
国别省市：
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