本发明专利技术对已有的mtDNA的提取和纯化方法进行整合和改进，形成一种新的提取与纯化方法，克服了Triton法产量低、易降解的弊端。高盐沉淀法操作简单，易重复，可依需用量扩大反应体系，使mtDNA质量得以轻松控制且纯度较高。鉴于优秀冰雪运动员较于常人的特殊体质特征，该方法特别适用于优秀冰雪运动员血液来源的mtDNA的提取与纯化方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种线粒体DNA(mtDNA)提取与纯化的方法，本专利技术特别适用于优秀冰雪运动员血液来源的mtDNA的提取与纯化，属于体育科学和生物科学的交叉学科。
技术介绍
线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器，它含有自己的DNA,具有相对独立的遗传系统它是细胞进行氧化磷酸化的场所。线粒体基因组不仅是研究DNA结构与复制转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。mtDNA是共价闭合的环状双链分子，对于不同的生物其分子量大小不一样。研究证实人类mtDNA的全部核苷酸序列为16569bp。mtDNA不同于核DNA的一个突出特点就是以母性遗传方式遗传，在遗传过程中mtDNA通过卵细胞质传递给后代。这种遗传方式便于进行群体分析，一个个体就能代表一个母性集团，因此只需少量个体样本便能反映一个群体的遗传结构。优秀的冰雪运动员要具有良好的心肺功能、有氧代谢能力，其线粒体中酶活性及个数较正常人偏高。人血液中的血细胞有红细胞、白细胞和血小板。红细胞无细胞核和细胞器，血液中的mtDNA主要来源于白细胞和血小板。正常人安静时血液中的白细胞总数在4000 10000个/mm3 或4 11.0X 109/L之间变动。白细胞生理性增高往往有以下情况，如剧烈运动、体力劳动、冷热水浴后、酷热和严寒、紫外线照射、情绪激动、刺激等因素都可导致白细胞数量增高。故总体上讲优秀冰雪运动员血液中白细胞的数量应较正常人偏多。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提取mtDNA的方法。本专利技术的目的是提供一种纯化mtDNA的方法本专利技术所提供的提取mtDNA的方法特别适用于优秀冰雪运动员。本专利技术聚焦于优秀冰雪运动员血液来源的mtDNA的提取与纯化。本专利技术对传统的mtDNA提取与纯化的方法进行了筛选、改进及优化，提取高获得率和高纯度的测序级mtDNA。具体实施例方式主要器械:低温冷冻离心机、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液器、恒温浴槽。药品与试剂:溶液I:139.6mmol/L NH4Cl, 16.96mmol/L 三羟甲基胺基甲烷 Tris-HCl，ρΗ7.2 ;溶液II:25mmol/L Tris-HCl ρΗ7.4,0.136mol/L NaCl，2.7mmol/L KCl ；溶液III:0.lmol/L NaCl, IOmmoI/L Tris-HCl pH7.6，lmmol/L EDTA ；溶液A:10mmol/L Tris-HCl pH7.5, NaCllOmmol/L, MgCl25mmol/L ；溶液B:10mmol/L Tris-HCl pH8.0, NaC1400mmol/L, EDTA2mmol/L。实验步骤1、抽取优秀冰雪运动员静脉全血5mL，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。 2、破碎红细胞(I)取EDTA抗凝血2mL,加入IOmL的溶液I,混勻，静置30min, 500r/min,离心8min。(2)用溶液II适量悬浮沉淀，分盛2个Eppendorf管中，以1500r/min速度离心4min。(3)用溶液II再悬浮沉淀，以1500r/min速度离心4min。(4)用适量溶液III洗I次，沉淀白细胞。3、高盐法提取mtDNA(I)取IO7细胞沉淀，加入溶液Α5500μ L，混匀，以3000r/min速度离心8min，弃上清。(2)取沉淀加溶液B5500 μ L，颠倒混匀，以3500r/min速度离心lOmin，弃上清。(3)弃上清，沉淀加溶液B950 μ L，混匀后加入20mg/mL蛋白酶K50 μ L和10 %SDS120 μ L，快速混匀。40°C过夜或50°C 4小时。(4)加入300 μ L饱和醋酸钠，颠倒混匀，轻摇15S。4°C以13000r/min速度离心20min,取上清于Eppendrof管中。(5)取上清后再加入300 μ L饱和醋酸钠，颠倒混匀，轻摇15S。4°C以13000r/min速度离心20min。4、mtDNA 的纯化(I)加入适量用 TE 溶解的 RNase (200mg/mL)，37°C，30min,消化 RNA。(2)上清中加入等体积酚:氯仿:异醇(25: 24: I)，温和振荡8min，4°C下以12000r/min 速度离心 12min。(3)取上层水相加入等体积氯仿，温和振荡8min,4°C以12000r/min速度离心12min。(4)取上清液加入等体积异丙醇，-20°C放置30min，以13000r/min速度离心25min,弃上清。(5)用70%冰乙醇漂洗沉淀，以15000r/min速度离心lOmin，弃上清。(6)再用70%冰乙醇漂洗沉淀，以15000r/min速度离心lOmin，彻底去上清。沉淀于空气中自然部分干燥25min，加入适量TE液溶解。5、mtDNA 样品鉴定(I)紫外分光光度法测定:样品经适当稀释，用紫外分光光度计测其D260/D280值鉴定纯度。(2)琼脂糖凝胶电泳:电泳用DYY-1112型电泳仪，I %琼脂糖凝胶，取6 μ L溶解液2 μ L上样液混匀后点样，紫外灯下观察并拍照。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种改进的高盐法提取与纯化mtDNA方法，其特征在提取mtDNA的高获得性。1)加入裂解细胞的溶液A、B后离心的转速分别上升到3000r/min与3500r/min，但是离心时间分别降低到8min与10min。2)mtDNA的纯化方法中将用异丙醇沉淀mtDNA的离心转速降低到13000r/min同时离心时间增加到25min。3)高盐法提取mtDNA中增加了消化RNA步骤，即用TE溶解的RNase(200mg/mL)，37℃，30min。
【技术特征摘要】
1.一种改进的高盐法提取与纯化mtDNA方法，其特征在提取mtDNA的高获得性。1)加入裂解细胞的溶液A、B后离心的转速分别上升到3000r/min与3500r/min，但是离心时间分别降低到8min与lOmin。2)mt...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘春华，郑丽，徐金庆，孙玉姣，陆涛峰，关伟军，
申请(专利权)人：哈尔滨体育学院，
类型：发明
国别省市：
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