一种用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法，所述方法包括如下步骤：（1）采集葡萄霜霉病菌菌样；（2）孢子囊悬浮液的制备；（3）葡萄品种及叶片的选择；（4）孢子囊悬浮液的接种；（5）叶片保湿培养。该方法简单易学，容易操作，对试验仪器要求不高，叶片发病后仍可以在相同环境条件下培养7-10天，且克服了以往葡萄霜霉病接种后难于成活、在室内不能对菌样进行大量繁殖、得不到充足孢子囊悬浮液的缺陷，可用于葡萄霜霉病的监测、致病性测定、药剂筛选等大型试验，具有较高的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地涉及。
技术介绍
目前葡萄霜霉病(Grape downy mildew)是葡萄种植中最重要的病害,在我国各葡萄产区均有分布，多发生在雨水较多的地区和年份，在5-6月份开始发生，7-9月为发病盛期。主要危害叶片，也能侵染嫩梢、花序、幼果等幼嫩组织。病害流行年份，病叶焦枯早落，病梢扭曲，发育不良，对树势和产量影响严重。截止2010年，全国葡萄栽培面积达到了552，OOOhm2，重病区的发病率在70%以上。葡萄霜霉菌是专性寄生真菌，叶片发病部位产生白色霜状霉层，即病菌的孢子囊及孢子囊梗。自气孔伸出的孢子囊梗上生孢子囊，孢子囊呈卵形或椭圆形，顶端有乳头状突起，在水中萌发时产生游动孢子。游动孢子呈肾形，在扁平的一侧生有两根鞭毛，能在水中游动，在水中游动变成圆形静止孢子，并同时长出芽管，经气孔侵入寄主。自然环境中，游动孢子通过雨水溅到葡萄幼嫩组织上，通过气孔侵入组织细胞进行初侵染。经过一定的潜育期，形成初次病斑-组织上的油状斑点，在初次病斑上形成孢子囊梗和孢子囊，孢子囊萌发产生的游动孢子又通过雨露进行再侵染。在整个生长季过程中，只要条件适宜，病菌就会不断进行重复侵染，使病害流行。葡萄霜霉病菌是专性寄生菌，在培养基上不能分离培养且在室内不能够大量繁殖，这严重限制了葡萄霜霉病菌室内监测抗药性、新药剂的筛选、新药剂抗药性风险评估及致病性分化等研究工作的开展。研究人员不得不只能在短时间内不断地去田间采集该病菌用于试验的需求,这样不但增加了工作量,试验成本也大大提高。因此,迫切需要专利技术一种简单易行的方法用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌，保证葡萄霜霉病菌的研究工作顺利展开。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，该方法可在室内大量培养繁殖葡萄霜霉病菌，且简单、易行。本专利技术的技术方案是利用葡萄霜霉病菌的侵染循环原理建立的该病菌的培养繁殖方法。具体的，该方法包括如下步骤:(I)采集葡萄霜霉病菌菌样:在不同地区的葡萄种植区采集葡萄霜霉病菌的病叶，低温o°c -10°C保存带回室内；(2)孢子囊悬浮液的制备:(Al)将病叶表面杂质和葡萄霜霉病菌表面老熟的孢子囊冲洗掉，在18°C -20°C下黑暗培养24h-32h诱导产生新生的孢子囊； (A2)将新生孢子囊冲下制成孢子囊含量为I X IO5个-1.5 X IO5个/mL的孢子囊悬浮液；(A3)将新生孢子囊悬浮液于4°C预冷20min-30min，室温放置待悬浮液温度为室温时用于接种；(3)甸甸品种及叶片的选择:甸甸品种米用易感霜霉病品种；叶片选择所述易感品种植株叶龄一致、枝条顶端第一至第三片完全展开的健康叶片；同时，所述葡萄植株及叶片生长期均未用过药且无霜霉病发生；(4)孢子囊悬浮液的接种:将孢子囊悬浮液用喷雾法离体接种(3)中所述健康葡萄叶片；(5)叶片保湿培养:(Al)在培养皿中铺有两层无菌水浸湿的滤纸上放置玻璃棒，待叶片接种后立即将接种后的叶片正面朝下放在玻璃棒上，叶片不与滤纸直接接触，叶柄用脱脂棉保湿，将培养皿密封；(A2)将上述装有叶片的培养皿置于18 °C -20 °C下黑暗、RH100%条件下培养24h-32h后进行光照培养12h，再进行黑暗培养12h，按此顺序以后每天18°C _20°C下进行12小时光照/黑暗交替培养至霜霉病菌侵染叶片发病产生大量孢子囊，此期间保证足够湿度 RH100%。优选地，本专利技术的用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法还包括如下步骤:(6)菌种纯化:待葡萄霜霉病菌侵染叶片开始形成病斑后，剪取某一病斑(病斑面积大小一定)进行单独培养，冲洗单一病斑孢子囊成孢子囊悬浮液，过滤离心，将孢子囊悬浮液稀释成孢子囊含量为I X IO5个-1.5 X IO5个/mL的孢子囊悬浮液，4°C低温诱导20min-30min，室温下放置一定时间，待孢子囊悬浮液温度为室温时，分散喷于葡萄叶片，逐天进行观察叶片发病情况，待霜霉病斑发生初期，继续对单一病斑进行剪切独立培养，连续重复两次，得到相对比较纯 的菌系，同样方法继续扩繁2代获得大量的孢子囊含量为IXlO5个-1.5 X IO5个/mL葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液；(7)将(6)中纯化后的孢子囊悬浮液按步骤(4)进行接种，并按步骤(5)进行叶片保湿培养至霜霉病菌侵染叶片发病产生大量孢子囊。纯化后的霜霉病菌可提高葡萄霜霉病的监测、致病性测定、药剂筛选等大型试验的可重复性和准确性。优选地，步骤(I)中在我国不同省份的不同葡萄种植区采集葡萄霜霉病菌的病叶，用保温箱低温0°c -10°C保存带回室内。进一步优选地，步骤(I)中，所述葡萄霜霉病菌菌样的采集是在我国不同省份的不同葡萄种植区采用5点法取样，每点取10个葡萄霜霉病菌的病叶，用保温箱低温0-10°C保存带回室内，进行进一步繁殖。葡萄霜霉病菌菌样的采集过程中必须低温0-10°C保存带回室内来保证病菌的生活力。优选地，步骤(2)中(Al)中在18°C下黑暗培养24h诱导产生新生的孢子囊。具体地，步骤(2)中(Al)中在压力0.08Mpa下用无菌水将病叶表面杂质和霜霉病菌表面老熟的孢子囊冲洗掉，将病叶置于放有湿润滤纸的培养皿中，用保鲜膜将培养皿封口，在18°C下黑暗保湿培养24h诱导产生新生的孢子囊。所述培养皿可用塑料盒或其他本领域常用的器皿代替。进一步优选地，步骤(2)中(Al)中用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器将病叶表面杂质和霜霉病菌表面老熟的孢子囊用无菌水冲洗掉。优选地，步骤(2)中(A2)中在压力0.08Mpa下用无菌水将新生孢子囊洗下来，4号定性滤纸过滤，以2000r/min离心5min，重复离心2次，配制成孢子囊含量为IXlO5个-1.5 X IO5个/mL的孢子囊悬浮液。所述4号定性滤纸属于定性滤纸的一种,优选为Whatman Grade4定性标准滤纸，其加快了流速和增加了负载力，大颗粒和胶状沉淀物保留能力强，可以使孢子囊与杂质充分分离，也可以使用除Grade4定性标准滤纸外的其它型号的滤纸，但有可能分离孢子囊时有一部分不能很好的被过滤或者有些杂质会在过滤时一起进入孢子悬浮液中。进一步优选地，步骤(2)中(A2)中用压力0.08MPa的QWJ-150型空压机带动喉头喷雾器用无菌水将新生孢子囊洗下来。优选地，将孢子囊悬浮液的浓度用血球计数板调整为I X IO5个-1.5 X IO5个/mL。在压力0.0SMpa下冲洗老熟的孢子囊和新生的孢子囊此时叶片损害程度较轻且孢子囊受到的撞击较小，利于病菌繁殖。新生孢子囊洗下后，离心来提高孢子囊浓度和去杂。优选地，步骤(2)中(A3)中于4°C 20min低温处理，室温放置一段时间待悬浮液温度为室温时用于接种。制成孢子囊悬浮液后经4°C 20min-30min低温处理能够促进游动孢子释放,待悬浮液温度为室温后即可进行接种。优选地，步骤(3)中，菌种接种及培养过程需严格注意葡萄品种和叶片选择。葡萄品种多采用易感霜霉病品种如欧 亚种群赤霞珠，或者采用部分欧美杂交种巨峰、高妻等；叶片有选择性的采集供试葡萄品 种叶龄一致、枝条顶端第一至第三片完全展开的健康叶片，此部位叶片接种霜霉病菌最易被霜霉病菌侵染并保证菌种的纯度。需注意的是，所述葡萄植株及叶片生长期均未用过药且无霜霉病发生。优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）采集葡萄霜霉病菌菌样：在不同地区的葡萄种植区采集葡萄霜霉病菌的病叶，低温0℃?10℃保存带回室内；（2）孢子囊悬浮液的制备：（A1）将病叶表面杂质和葡萄霜霉病菌表面老熟的孢子囊冲洗掉，在18℃?20℃下黑暗培养24h?32h诱导产生新生的孢子囊；（A2）将新生孢子囊冲下制成孢子囊含量为1×105个?1.5×105个/mL的孢子囊悬浮液；（A3）将新生孢子囊悬浮液于4℃预冷20min?30min，室温放置待悬浮液温度为室温时用于接种；（3）葡萄品种及叶片的选择：葡萄品种采用易感霜霉病品种；叶片选择所述易感品种植株叶龄一致、枝条顶端第一至第三片完全展开的健康叶片；同时，所述葡萄植株及叶片生长期均未用过药且无霜霉病发生；（4）孢子囊悬浮液的接种：将孢子囊悬浮液用喷雾法离体接种（3）中所述健康葡萄叶片；（5）叶片保湿培养：（A1）在培养皿中铺有两层无菌水浸湿的滤纸上放置玻璃棒，待叶片接种后立即将接种后的叶片正面朝下放在玻璃棒上，叶片不与滤纸直接接触，叶柄用脱脂棉保湿，将培养皿密封；（A2）将上述装有叶片的培养皿置于18℃?20℃下黑暗、RH100%条件下培养24h?32h后进行光照培养12h，再进行黑暗培养12h，按此顺序以后每天18℃?20℃下进行12小时光照/黑暗交替培养至霜霉病菌侵染叶片发病产生大量孢子囊，此期间保证湿度RH100%。...

【技术特征摘要】
1.一种用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)采集葡萄霜霉病菌菌样:在不同地区的葡萄种植区采集葡萄霜霉病菌的病叶，低温0°C -10°C保存带回室内； (2)孢子囊悬浮液的制备:(Al)将病叶表面杂质和葡萄霜霉病菌表面老熟的孢子囊冲洗掉，在18°C -20°C下黑暗培养24h-32h诱导产生新生的孢子囊； (A2)将新生孢子囊冲下制成孢子囊含量为I X IO5个-1.5 X IO5个/mL的孢子囊悬浮液； (A3)将新生孢子囊悬浮液于4°C预冷20min-30min，室温放置待悬浮液温度为室温时用于接种； (3)甸甸品种及叶片的选择:甸甸品种米用易感霜霉病品种；叶片选择所述易感品种植株叶龄一致、枝条顶端第一至第三片完全展开的健康叶片；同时，所述葡萄植株及叶片生长期均未用过药且无霜霉病发生； (4)孢子囊悬浮液的接种:将孢子囊悬浮液用喷雾法离体接种(3)中所述健康葡萄叶片; (5)叶片保湿培养:(Al)在培养皿中铺有两层无菌水浸湿的滤纸上放置玻璃棒，待叶片接种后立即将接种后的叶片正面朝下放在玻璃棒上，叶片不与滤纸直接接触，叶柄用脱脂棉保湿，将培养皿密封； (A2)将上述装有叶片的培养皿置于18°C -20°C下黑暗、RH100%条件下培养24h_32h后进行光照培养12h，再进行黑暗培养12h，按此顺序以后每天18°C -20°C下进行12小时光照/黑暗交替培养至霜霉病菌侵染叶片发病产生大量孢子囊，此期间保证湿度RH100%。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，本发明的用于室内培养繁殖葡萄霜霉病菌的方法还包括如下步骤: (6)菌种纯化:待葡萄霜霉病菌侵染叶片形成病斑后，剪取某一病斑进行单独培养，冲洗单一病斑孢子囊成孢子囊悬浮液，过滤离心，将孢子囊悬浮液稀释成孢子囊含量为I X IO5个-1.5 X IO5个/mL的孢子囊悬浮液，4°C低温诱导20min-30min，待孢子囊悬浮液温度为室温时，分散喷于葡萄叶片，待霜霉病斑发生初期，继续对单一病斑进行剪切独立培养，连续重复两次，得到相对比较纯的菌系，同样方法继续扩繁2代获得孢子囊含量为I X IO5个-1.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：马志强，毕秋艳，张小风，王文桥，韩秀英，
申请(专利权)人：河北省农林科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：