H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品技术

本发明专利技术公开了一种流感病毒rRT-PCR(real-time?RT-PCR)检测引物和探针及检测流感病毒的方法及H7N9亚型流感病毒标准品，包括H7N9亚型流感病毒特异性引物和探针3种共9条寡核苷酸引物和探针序列，同时包括待检样本的处理、rRT-PCR反应体系及反应条件、结果分析。能快速有效的甄别人和动物中的H7N9亚型流感病毒。操作简单、应用方便，为临床诊断、检验检疫等领域的流感疫情早期预警机制提供了可行的技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种rRT-PCR检测技术及其标准品的制备，尤其涉及一种H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品。
技术介绍
流感病毒基因组由8条(甲、乙型)或者7条(丙型)负链RNA节段构成。根据病毒的核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为甲型、乙型、丙型。其中A型流感病毒根据血凝素(HA)基因分为HA1-16亚型，根据神经氨酸酶基因(NA)分为NA1-9亚型。H7N9亚型流感病毒是A型流感病毒的一种，禽类是其天然宿主，亚洲、北美洲等地区多个国家的禽类养殖场中检测到过H7N9禽流感病毒。动物实验表明，H7N9亚型流感病毒能够感染雪貂的上呼吸道和下呼吸道，提示其具有感染人的风险，目前尚无一种快速、灵敏的方法用于检测H7N9亚型流感病毒及其重配变异株。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简单、应用方便的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的: 本专利技术的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测弓I物和探针，包括以下一种或多种弓I物和探针:H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针、H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针；所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒HA基因相对保守区；所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒NA基因相对保守区。本专利技术的应用上述的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，包括步骤:首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA ；然后，利用一步法或两步法rRT-PCR试剂加入所述引物和探针进行核酸扩增；之后，根据Ct值判断rRT-PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。本专利技术的流感病毒标准品，含有H7和N9亚型的全长基因，用于上述检测流感病毒的方法的阳性对照品。由上述本专利技术提供的技术方案可以看出，本专利技术所述的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品，由于包括针对H7N9亚型流感病毒HA基因和NA基因相对保守区引物和探针，可以通过rRT-PCR法检测H7N9亚型流感病毒及其变异株，操作简单、应用方便。具体实施例方式本专利技术的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR (real-time RT-PCR)检测引物和探针，其较佳的具体实施方式是，包括以下一种或多种引物和探针:H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针、H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针；所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒HA基因相对保守区；所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒NA基因相对保守区。所述引物和探针包括长度为18 31bp的寡核苷酸片段。所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针包括以下两套引物/探针组合，共计四条引物序列和二条探针序列:第一套:弓丨物序列:5’ AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3，、5，GGTCTTTCCTTGTATTTTTGTATGACTTAG3，；探针序列:5’FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3’ ；第二套:引物序列:5’TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3’、5’ TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3’ ；探针序列:5’FAM-ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA-BHQ1-3’ ；所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列:弓丨物序列:5，TGGCAATGACACACACTAGTCAGT3，、5，ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT3，；探针序列:5，FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3，。所述探针序列两端的标记FAM、BHQl为荧光素标记。本专利技术的应用上述的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，其较佳的具体实施方式包括步骤:首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA ；然后，利用一步法或两步法rRT-PCR试剂加入所述引物和探针进行核酸扩增；之后，根据Ct值判断rRT-PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。所述流感病毒包括以下一种或多种病毒:禽H7N9亚型流感病毒、内部基因变异的禽H7N9亚型流感病毒、人感染H7N9亚型流感病毒、人感染内部基因变异的H7N9亚型流感病毒。本专利技术的流感病毒标准品，其较佳的具体实施方式是:含有H7和N9亚型的全长基因，用于上述的检测流感病毒的方法的阳性对照品。进一步用于H7和N9的RNA体外转录和蛋白质体外合成。本专利技术中的引物和探针序列(5’ 一3’)及其检测的靶片段如下:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种H7N9亚型流感病毒rRT?PCR检测引物和探针，其特征在于，包括以下一种或多种引物和探针：H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针、H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针；所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒HA基因相对保守区；所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒NA基因相对保守区。

【技术特征摘要】
1.一种H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，其特征在于，包括以下一种或多种引物和探针: H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针、H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针； 所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒HA基因相对保守区； 所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒NA基因相对保守区。2.根据权利要求1所述的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括长度为18 31bp的寡核苷酸片段。3.根据权利要求2所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，其特征在于: 所述H7N9亚型流感病毒HA基因 特异性引物和探针包括以下两套引物/探针组合，共计四条引物序列和二条探针序列: 第一套:引物序列:5’ AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3’、5’ GGTCTTTCCTTGTATTTTTGTATGACTTAG3’ ； 探针序列:5’ FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3’ ； 第二套:引物序列:5’ TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3’、5’ TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3’ ； 探针序列:5’ FAM-ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA-BHQ1-3’ ； 所述H7N9亚型流...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒跃龙，赵翔，王大燕，高荣保，李晓丹，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：