小链霉菌的应用制造技术

本发明专利技术公开了小链霉菌(Streptomyces?parvus)CGMCC?No.4027的应用，用于通过发酵制备arylomycin?A2和arylomycin?A4。本发明专利技术为arylomycins的制备提供了一条新途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物发酵领域,具体涉及小链霉菌(Streptomyces parvus)CGMCCN0.4027用于制备arylomycins的应用。
技术介绍
Alexandra H0ltzel等在 2002 年从 Streptomyces sp.TU6075 分离得到了两组脂月太类化合物 arylomycins,包括 arylomycins A 和 arylomycins B (Schimana, Gebhardt etal.2002)。它们都属于六肽化合物，含有相同肽链(D-Me-Ser-D-Ala-Gly-L-Me-Hpg-L-Ala-L-Tyr),不同的是，arylomycins B中的Tyr含有-NO2取代基。本专利技术的申请人通过自然筛选的方法获得了一株小链霉菌(Streptomycesparvus)，于2010年7月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心正式保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏号为:CGMCCN0.4027。目前对其次级代谢产物的研究较少。
技术实现思路
本专利技术的申请人在对小链霉菌(Streptomyces parvus)CGMCC N0.4027的代谢产物的研究过程中，分离得到了两种化合物，经结构鉴定为arylomycin A2和arylomycin A4。因此，本专利技术的目的在于，提供一种小链霉菌(Streptomyces parvus)CGMCCN0.4027 的应用，用于通过发酵制备 arylomycin A2 和 arylomycin A4。根据本专利技术的一个优选实施例，所述发酵的种子培养条件为:培养温度为28 30°C，培养时间为46 50h ；种子培养基组成:葡萄糖2%，可溶性淀粉8%，黄豆饼粉5%，磷酸氢二钾0.02%，pH 7.0 7.5。根据本专利技术的一个优选实施例，所述发酵的摇瓶发酵条件为:发酵温度为28 30°C，发酵时间为4 6天； 发酵培养基组成:黄豆饼粉2.4%，糊精3.2%，葡萄糖0.6%，磷酸氢二钾0.02%，氯化钠 0.15%, pH 7.0 7.5。根据本专利技术的一个优选实施例，所述发酵的发酵罐发酵条件为:发酵温度为28 30°C，发酵时间为4 6天；发酵培养基组成:糊精6%，黄豆饼粉2%，磷酸氢二钾0.02%，氯化钠0.15%, pH7.0 7.5。根据本专利技术的一个优选实施例，所述arylomycin A2和arylomycin A4的制备还包括将发酵液经大孔树脂吸附和制备型HPLC分离的步骤。本专利技术的小链霉菌(Streptom yces parvus) CGMCC N0.4027可以发酵生产arylomycinA2 和 arylomycinA4,为 arylomycins 的制备开辟了一条新途径。附图说明图1为arylomycins的结构示意图。图2为制备液相色谱图。图3为化合物I的高分辨质谱图。图4为化合物2的高分辨质谱图。图5为化合物I的氨基酸分析图。图6为化合物2的氨基酸分析图。图7为化合物I的MS /MS谱图。图8为化合物2的MS/MS谱图。图9为化合物I的氢谱图。图10为化合物I的碳谱图。图11为化合物I的二维谱谱图，其中(a)为cosy谱图，(b)为cbpt谱图，(C)为HMBC谱图，(d)为HMQC谱图，(e)为TOCSY谱图。图12为化合物2的氢谱图。图13为化合物2的碳谱图。具体实施例方式以下通过具体实施例，对本专利技术做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。本专利技术所用的菌种为小链霉菌(Streptomyces parvus),已于2010年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC N0.4027。以下实施例中所使用的培养基的配方(w/v)如下:斜面培养基:可溶性淀粉2%，硝酸钾0.1%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.05%，琼脂 2%，pH 7.2 7.4。种子培养基:葡萄糖2%，可溶性淀粉8%，黄豆饼粉5%，磷酸氢二钾0.02%，pH7.0 7.5。摇瓶用发酵培养基:黄豆饼粉2.4%，糊精3.2%，葡萄糖0.6%，磷酸氢二钾0.02%，氯化钠 0.15%, pH 7.0 7.5。发酵罐用发酵培养基:糊精6%，黄豆饼粉2 %，磷酸氢二钾0.02%,氯化钠0.15%, pH 7.0 7.5。以上培养基均以蒸馏水配制，经121°C饱和蒸汽灭菌30min后使用。实施例1、化合物的制备1.1 发酵将小链霉菌(Streptomyces parvus) CGMCC N0.4027菌种从冻干管中接种到斜面培养基上，于28°C 30°C培养四天后，转入装有种子培养基的三角瓶中，置于摇床进行种子培养，其中，摇床转速为200 230rpm，温度为28 30°C，培养时间为46 50h。种子培养结束后，按4%转种量转入装有发酵培养基的三角瓶内，进行摇瓶发酵培养，摇床转速为150 300rpm，温度28 30°C，培养6天后，发酵结束。经种子培养后也可按4%转种量转入装有发酵培养基的5L玻璃发酵罐内，进行发酵，搅拌转速为300 500rpm，温度控制在28 30°C，通气量为7 9L/min，培养4 6天后结束发酵。1.2样品分离纯化将1.1中获得的发酵液置于4°C冰箱中过夜，沉淀蛋白。之后将发酵液于4°C、4000rpm离心30min。弃下层沉淀，上清液用大孔吸附树脂吸附，大孔吸附树脂可以采用XAD-1600，SP850，或JD-1，于静态或动态进行吸附皆可，吸附时间不少于3小时。吸附后用两倍柱体积的纯水、10 %、30 %、50 %、75 %、100 %乙醇依次洗脱，粗品集中在75 %乙醇洗脱液中。粗品液用旋转蒸发仪于40°C减压浓缩，再采用中压层析系统进行粗制。条件如下:粗品浓缩液用45%·乙腈稀释10倍，12000rpm离心lOmin，上清为进样样品。上样量为15 25ml，采用中压柱(型号:Biotage Si 25+M 1603-2，USA)进行分离，柱温自然，流动相为45%乙腈500ml,等度洗脱。流速约3 5ml/min,样品集中于300 500ml的洗脱液中。洗脱液用旋转蒸发仪于40°C减压浓缩后采用D10NEXP680双元泵制备液相系统进行制备，收集到的制备液于40°C旋蒸浓缩至干获得目标化合物纯品。液相制备条件如下:制备柱:YMCCombiPreP ODS-A 5μπι 20X250mm柱温:自然检测器:DAD(210nm, 223nm, 254nm, 280nm)流速:8ml/min进样量:60 700 μ I洗脱液配方如下:0.2% (w/v)的醋酸铵加0.12% (v/v)的冰醋酸配成pH 4.69的缓冲液，再用缓冲液与乙腈配成50% (v/v)乙腈的流动相，等度洗脱。液相制备结果如图2所示。截取保留时间为18.3min和15.4min的物质，分别命名为化合物1、化合物2，两物质均为白色粉末，易溶于甲醇、乙醇、水、乙腈。实施例2、化合物的结构鉴定将实施例1中获得的样品经高分辨质谱检测，图谱如图3、图4所示，化合物I的精确分子量为838.4603，化合物2的精确分子量为824.4本文档来自技高网...

【技术保护点】
小链霉菌(Streptomyces?parvus)CGMCC?No.4027的应用，其特征在于，用于通过发酵制备arylomycins，其中，所述arylomycins包括arylomycin?A2和arylomycin?A4。

【技术特征摘要】
1.小链霉菌(Streptomycesparvus)CGMCC N0.4027的应用，其特征在于,用于通过发酵制备 arylomycins,其中，所述 arylomycins 包括 arylomycin A2 和 arylomycin A4。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵的种子培养条件为: 培养温度为28 30°C，培养时间为46 50h ； 种子培养基组成:葡萄糖2 %，可溶性淀粉8 %，黄豆饼粉5 %，磷酸氢二钾0.02%，pH7.0 7.5。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵的摇瓶发酵条件为: ...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶敏，罗敏玉，靳旭，阮丽军，戈梅，夏兴，潘志梁，廖灵巧，
申请(专利权)人：上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司，浙江医药股份有限公司新昌制药厂，
类型：发明
国别省市：